Clinical and Genetic Heterogeneity of the 15q13.3 Microdeletion Syndrome

Abstract

The 15q13.3 microdeletion is a recurrent CNV, presumibilmente mediato da NAHR tra duplicazioni segmentali nel cromosoma 15. La delezione e la duplicazione 15q13.3 sono associate a una vasta gamma di manifestazioni cliniche, come deficit intellettuali, convulsioni, autismo, linguaggio e ritardo nello sviluppo, disturbi neuropsichiatrici e problemi comportamentali che illustrano penetranza ed espressività incomplete. Questo studio comprende una valutazione di 106 pazienti sintomatici che portano la delezione eterozigote, così come di 21 pazienti che portano la duplicazione, che sono stati descritti in studi precedenti. L’analisi mostra una notevole eterogeneità per la manifestazione di diversi sintomi chiave e l’occorrenza familiare. Inoltre, vengono introdotti 8 nuovi pazienti. Le connessioni familiari contorte danno nuove intuizioni sulla complessità della manifestazione sintomatica. In studi precedenti, sono state espresse opinioni diverse sulla natura e la posizione precisa dei punti di rottura della delezione. Qui, dimostriamo che non CHRNA7 e CHRFAM7A, ma piuttosto FAM7A o GOLGA8, servono come regioni di breakpoint riguardanti i nostri pazienti. La delezione è descritta come eterogenea nelle dimensioni. Tuttavia, supponiamo che non solo i diversi breakpoint, ma anche l’imprecisione dell’analisi aCGH sul cromosoma 15 a causa delle duplicazioni segmentali sia responsabile della variabilità delle dimensioni.

© 2016 S. Karger AG, Basel

La sindrome da microdelezione 15q13.3 (OMIM 612002), che è stata descritta per la prima volta da Sharp et al. , è una CNV ricorrente, presumibilmente mediata da NAHR tra duplicazioni segmentali (BP3-BP5, BP4-BP5) nel cromosoma 15. La delezione e la duplicazione 15q13.3 sono associate a una vasta gamma di disturbi del neurosviluppo, come deficit intellettuali, convulsioni, autismo, linguaggio e ritardo nello sviluppo, disturbi neuropsichiatrici e problemi comportamentali che mostrano penetranza incompleta ed espressività variabile. La tipica delezione di 1.6 Mb ospita 7 geni: ARHGAP11B, MTMR10, MTMR 15, TRPM1, KLF13, OTUD7A e CHRNA7. CHRNA7 codifica per il recettore nicotinico neuronale dell’acetilcolina alfa7 e, pertanto, è considerato il principale gene candidato responsabile delle caratteristiche cliniche espresse.

In questo studio, descriviamo 6 pazienti finora inediti che portano la tipica microdelezione 15q13.3 tra BP4 e BP5, compresa una famiglia con 4 membri affetti che sono descritti più avanti. Inoltre, sono descritti 1 paziente con una duplicazione 15q13.3 e 1 paziente portatore di una delezione di 3,4 Mb tra BP3 e BP5.

Inoltre, per spiegare la varietà delle manifestazioni cliniche e la gravità dei sintomi, abbiamo rivisto i dati di 106 pazienti sintomatici con delezione eterozigote 15q13.3 e 21 pazienti con duplicazioni che sono stati riportati.

In studi recenti, sono sorte opinioni diverse sulla natura e la posizione precisa dei breakpoint della delezione. Abbiamo studiato la posizione del breakpoint usando il FISH per confermare fino a che punto queste opzioni si dimostrano vere per i nostri pazienti.

Metodi

Estrazione del DNA e Array CGH

Leucociti di sangue periferico sono stati usati come fonte di DNA. L’analisi Array-CGH è stata eseguita utilizzando un array Sure Print 4x180K (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif., USA). Il DNA del paziente è stato marcato con Cy3, il DNA di riferimento con Cy5. L’ibridazione è stata effettuata utilizzando il DNA Cot-1 (1,0 µg/ml). I campioni di DNA del test sono stati ibridati con DNA di riferimento abbinato al sesso (Agilent). Le fasi di purificazione, ibridazione e lavaggio sono state eseguite secondo le istruzioni del produttore. Sono stati utilizzati Sure Scan microarray Scanner G2600D (Agilent), Feature Extraction software (Agilent) e Agilent Cytogenomics Software Edition 2.0.6.0.

FISH e Breakpoint Analysis

I vetrini con metafasi di linfociti periferici coltivati sono stati conservati a -70°C. Prima dell’ibridazione, i vetrini sono stati trattati in una serie di alcool (70, 80 e 100%), seguita da un trattamento con pepsina (15 min, 37°C). BACs marcati in fluorescenza (Illumina®, BlueFish) sono stati utilizzati come sonde FISH. Preparazione sonda, ibridazione e fasi di lavaggio sono stati eseguiti secondo le istruzioni di Illumina.

BAC sonde utilizzate erano RP11-11H9, 22.067.176-22.300.706, chr.15q11.2; RP11-40J8, 30.546.758-30.724.265, chr.15q13.2; RP11-348B17, 31.281.641-31.502.115, chr.15q.13.3; RP11-265I17, 32.293.149-32.457.541, chr.15q13.3; RP11-280K19, 32.654.212-32.821.799, chr.15q13.3, e RP11-232J12, 53.792.861-53.948.902, chr.15q21.3 (vedi fig. 1, hg19).

Risultati

Valutazione clinica

I pazienti sono stati inizialmente osservati in occasione della visita neuropediatrica a causa di deficit intellettivi e/o ritardo dello sviluppo. La tabella 1 riassume i risultati citogenetici e clinici.

Descrizione dei pazienti

Paziente 1 (III/1)

La ragazza di 13 anni ha presentato un disturbo da deficit di attenzione e iperattività (ADHD), deficit intellettivi, ritardo nello sviluppo, infezioni respiratorie ricorrenti e scoliosi. Il suo peso e la circonferenza della testa (OFC) variano intorno al 10° percentile (P), rispettivamente P90. Frequenta una scuola speciale. Anche sua madre (II/2, in fig. 2) frequenta una scuola per l’educazione speciale e la completa con successo. Entrambi i genitori non sono stati disponibili per ulteriori indagini. Il paziente 1 è una sorellastra dei pazienti 2 e 3, e il cugino del paziente 4.

Paziente 2 (III/2)

Il paziente femmina è stato introdotto all’età di 9 e ha mostrato ritardo di sviluppo e di linguaggio, nonché deficit intellettuali (K-ABC-Test: IQ 63). Un EEG da sveglia ha mostrato alterazioni generali, ma finora non si sono verificate crisi. Il suo OFC è tra P3 e P10, peso e altezza sono nella norma. L’ADHD è trattato con metilfenidato. Viene descritta come una persona allegra ma anche aggressiva e impulsiva e frequenta una scuola speciale. Entrambi i genitori non sono stati disponibili per ulteriori indagini.

Paziente 3 (III/3)

Al paziente di 10 anni è stato diagnosticato un disturbo di apprendimento, che non è stato ulteriormente definito. Le misure corporee della bambina mostrano una forte variazione nel tempo. Fino all’età di 2 anni, il suo OFC era P<3; attualmente, il suo peso è P97. È obesa, mostra un comportamento stereotipato e frequenta una scuola speciale.

Paziente 4 (III/6)

L’esame del paziente (13 anni) ha rivelato un ritardo linguistico e psicomotorio così come un lieve deficit intellettuale (HAWIK-IV: SW 56). Le caratteristiche degne di nota sono la dislalia multipla e l’ADHD, che è trattata con metilfenidato (10-15 mg/giorno). L’EEG del ragazzo è irrilevante, il suo OFC è normale, l’altezza P90 e il peso P97. Il carattere del paziente è descritto come amichevole ma a volte aggressivo e impulsivo. Frequenta una scuola per handicappati. Entrambi i genitori hanno frequentato una scuola speciale. Suo padre (II/5) è in prigione per aggressione. Anche le sue 2 sorelle (III/7, III/8) frequentano una scuola speciale, e il suo fratellastro (III/9) mostra un ritardo nello sviluppo e nel linguaggio, ma non porta la delezione. Il paziente è il cugino dei pazienti 1, 2 e 3. I genitori non sono stati disponibili per le indagini.

Paziente 5

Il paziente (14 anni) ha presentato un comportamento sociale anormale e ADHD. A causa del suo scarso rendimento scolastico e della discrepanza tra il suo rendimento intellettuale (HAMIK-IV, QI 78) e la media della famiglia, è stato avviato un esame medico. Dopo una crisi epilettica, è stato trattato con successo con Orfiril®. L’ADHD è trattato con metilfenidato (5-10 mg/giorno). I suoi genitori non sono stati disponibili per le indagini.

Paziente 6

Da bambino, il paziente 6 ha manifestato un ritardo nello sviluppo e nel linguaggio. Ha mostrato segni di ipotonia. Al momento dell’esame, il paziente di 19 anni ha presentato deficit intellettuali e ADHD. Il trattamento con metilfenidato è stato interrotto dopo che il paziente ha iniziato lo sport ad alte prestazioni, che si è rivelato un trattamento efficace dei sintomi dell’ADHD. Sua madre non è un portatore di delezione. Suo padre non è stato disponibile per le indagini.

Paziente 7

Il paziente è stato esaminato all’età di 7 anni e ha rivelato lievi deficit intellettuali (K-ABC-Test, SW: 63). Le sue misure corporee sono tutte entro il P10. È descritto come irrequieto e disattento. Frequenta una scuola speciale. I suoi genitori non sono stati disponibili per le indagini.

Paziente 8

Il paziente è nato con un difetto cardiaco (difetto del setto ventricolare e difetto del setto atriale). Mostra caratteristiche dismorfiche come orecchie basse, ipertelorismo, strabismo e ipotonia. Il suo sviluppo psicomotorio è ritardato. La lunghezza e l’OFC del paziente alla nascita erano P50, il suo peso era P10. Ha ereditato la duplicazione da suo padre che mostra un fenotipo irrilevante. Uno zio (sul sito materno) con epilessia e ipertermia maligna è stato segnalato.

Analisi del breakpoint

Negli studi precedenti, l’eterogeneità della dimensione della delezione è stato un argomento di interesse. Shinawi et al. hanno ipotizzato che FAM7A1/2 funzioni come breakpoint, mentre Szafranski et al. hanno sospettato che CHRNA7 e CHRFAM7A siano responsabili della delezione ricorrente nel locus 15q13.3. Antonacci et al. hanno suggerito la famiglia di geni GOLGA8 come possibili candidati. Si è cercato di convalidare queste teorie utilizzando il FISH. La sonda 4 contrassegna CHRNA7, la sonda 5 contrassegna FAM7A, la sonda 2 contrassegna CHRFAM7A e la sonda 3 contrassegna una regione distalmente a CHRFAM7A (fig. 1). Nei nostri pazienti, FAM7A è rilevabile in entrambi i cromosomi 15. Questo risultato indica che il breakpoint distale si trova tra CHRNA7 e FAM7A. L’analisi dei pazienti 7 e 4 mostra che il breakpoint prossimale si trova distalmente a CHRFAM7A (figg. 3, 4). Nel paziente 7, la sonda 3 fa da ponte al breakpoint. Pertanto, CHRNA7 e CHRFAM7A non mediano la delezione ricorrente per quanto riguarda i nostri pazienti.

Valutazione dei pazienti sintomatici descritti in studi precedenti

Per i pazienti e gli studi vedere la tabella 2 e il materiale supplementare online 1 (per tutto il materiale supplementare online, vedere www.karger.com/doi/10.1159/000443343). L’analisi statistica è stata eseguita con il test esatto di Fisher, utilizzando il software ‘R’. I risultati con p < 0,05 sono stati valutati come significativi.

Discussione

La famiglia che presentiamo mostra caratteristiche interessanti. Da un lato, il grado di parentela varia; dall’altro, anche i sintomi sono diversi (fig. 2). Tuttavia, non c’è una connessione dimostrabile tra il grado di parentela e i sintomi. I pazienti 2 e 3, che sono sorelle, sono notevolmente diversi. Variano considerevolmente nelle misure corporee, nel carattere e nella gravità dei sintomi, sebbene siano esposte a fattori ambientali simili e portino la stessa dimensione della delezione. Pertanto, altri fattori genetici sono destinati a influenzare il grado delle manifestazioni cliniche. Una possibile spiegazione potrebbe essere un’espressione alterata dei suoi geni nel genoma, che può avere effetti diversi. Questo approccio è stato ulteriormente confermato da Henrichsen et al. , che hanno dimostrato che le regioni CNV sono espresse a livelli inferiori e più variabili e modificano l’espressione dei geni vicini. Chaignat et al. hanno affermato che le CNV alterano i tempi di espressione dei geni durante lo sviluppo nei topi. Inoltre, diversi modelli temporali di espressione possono essere trovati in diversi individui. Inoltre, l’espressione alterata o le mutazioni di diversi geni che codificano per diverse fasi della stessa via neurobiologica potrebbero intensificare i sintomi neurologici. Poot et al. suggeriscono diversi meccanismi che possono portare alla pleiotropia fenotipica delle CNV, per esempio, l’interazione delle CNV, l’epistasi genetica o l’esclusione allelica.

Tre membri della famiglia su 4 manifestano ADHD; tutti mostrano un ritardo nello sviluppo. Poiché l’origine dell’ADHD apparentemente è multifattoriale, non è sorprendente trovare un accumulo in una famiglia. Notevolmente, tutti i bambini sono colpiti dalla delezione. Particolari costellazioni genetiche familiari probabilmente aumentano la probabilità di manifestare i sintomi. Inoltre, l’ambiente intrauterino della madre portatrice della delezione può aver influenzato il fenotipo dei suoi figli. Tuttavia, nessuna CNV condivisa che correla con la comparsa dei sintomi potrebbe essere identificata, e nessuna seconda CNV patogena potrebbe essere identificata in nessuno dei nostri pazienti.

L’analisi del breakpoint mostra che il breakpoint distale è posizionato distalmente a CHRNA7. Possibili posizioni sarebbero all’interno delle famiglie di geni FAM7A o GOLGA8, come è già stato suggerito, o all’interno delle regioni di controllo del locus. Il breakpoint prossimale si trova distalmente a CHRFAM7A. Nei pazienti 1-4, che appartengono ad una famiglia, le dimensioni della delezione rilevate dal software di analisi aCGH differiscono. Queste differenze sono dovute a lacune nel modello di distribuzione degli oligonucleotidi nell’aCGH all’interno e intorno alle regioni di breakpoint. Lievi cambiamenti nel rapporto log degli oligonucleotidi posizionati marginalmente si traducono in un considerevole spostamento della dimensione della delezione rilevata dal software di analisi. La differenza evidente nella dimensione della delezione ricorrente 15q13.3 è molto probabilmente un artefatto del software di elaborazione. Assumiamo che la delezione sia identica in dimensioni per tutti i membri della famiglia (vedi suppl. materiale online 2).

Diversi studi CNV hanno rivelato un’associazione del 15q13.3 microdelezioni con schizofrenia, epilessia e autismo. Sono state pubblicate diverse pubblicazioni che presentano nuovi casi e teorie sui breakpoint e sui fattori che alterano i sintomi. Sono stati fatti sforzi per unire queste informazioni al fine di trovare nuove connessioni.

I risultati lasciano spazio a speculazioni. Le delezioni sono ereditate nell’80,88%. La decenza materna è descritta sproporzionatamente più spesso per le delezioni (54,41%, p = 0,001) e le duplicazioni (53,33%, p = 0,027).

Una spiegazione potrebbe essere data da Sinkus et al. Hanno studiato l’impatto dei polimorfismi del promotore di CHRNA7, che diminuiscono il livello di trascrizione del ∼25% e influenzano il livello di cortisolo nella madre e nel bambino. Il livello di cortisolo del bambino si abbassa ulteriormente se sia la madre che il bambino sono portatori del polimorfismo. L’impatto del circondario intrauterino può anche avere un’influenza su altri fattori. L’OFC è ridotto nei pazienti se la delezione è ereditata dalla madre (P<25 nel 50%, p = 0,002). Pertanto, supponiamo che se l’aberrazione è ereditata dalla madre, l’intorno intrauterino intensificherà i sintomi. Poiché abbiamo incluso solo i pazienti sintomatici in questa valutazione, questo spiegherebbe perché la maggior parte delle aberrazioni sono apparentemente di origine materna (54%, p = 0,001). In questo contesto, è sorprendente che la distribuzione di genere della delezione sia uguale. I nostri dati confermano i risultati di Lowther et al. Nella loro revisione completa della delezione 15q13.3, hanno combinato pazienti sintomatici e asintomatici. Poiché abbiamo incluso solo i pazienti sintomatici, le proporzioni dei modelli di distribuzione delle caratteristiche sono simili ma i numeri relativi differiscono. Per quanto riguarda l’aumento del decoro materno delle delezioni, affermano una ridotta idoneità riproduttiva nei maschi come possibile spiegazione.

La dimensione della delezione non correla coerentemente con il grado dei sintomi. Per esempio, confrontando il grado di deficit intellettuali con la dimensione della delezione non mostra alcuna connessione lineare. I pazienti con la tipica delezione di 1.6 Mb mostrano deficit gravi più frequentemente dei pazienti con delezioni più piccole o più grandi (41.07%, p = 0.00045). I deficit intellettuali sono riportati significativamente più spesso nei pazienti con delezioni che duplicazioni (79.78 e 55.56%, p = 0.037). Come previsto, l’intelligenza normale è descritta più spesso nei pazienti con delezioni <1 Mb (45%, p = 0.0037).

Le delezioni con una dimensione di 1-1.6 Mb sono più frequenti (63.21%, p = 0.0002). Duplicazioni <1 Mb (66.67%, p = 0.0004) sono più comunemente descritte. Per quanto riguarda le delezioni, deficit intellettuali (79.78%), disturbo del linguaggio (75.34%), un fenotipo evidente dei genitori (66.67%), e problemi comportamentali (63.64%) sono descritti molto più spesso di epilessia (30.61%) o autismo (27.71%) (p = 0.02-3.931E-09). Confrontando le duplicazioni e le delezioni, le duplicazioni sono associate più spesso con l’autismo (p = 0,039) e il fenotipo dei genitori è notevolmente meno frequente (p = 0,027).

L’epilessia è significativamente associata con deficit intellettivi lievi (59,09%, p = 0,0029). Il disturbo del linguaggio è associato a deficit intellettuali nel 79,24% dei casi (p = 0,003).

Per concludere, si può dire che il fenotipo clinico della microdelezione 15q13.3 è di origine multifattoriale. Anche i membri stretti della famiglia esposti a fattori ambientali simili differiscono significativamente nelle loro manifestazioni cliniche. La consulenza genetica nelle famiglie con microdelezioni 15q13.3 o in particolare microduplicazioni rimane quindi complessa e occasionalmente inadeguata. Ulteriori indagini nelle alterazioni genetiche riguardanti l’allele non eliminato o le regioni promotrici dei geni colpiti possono essere più promettenti quando si tratta di scoprire i fattori di influenza.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Margot Fliegauf, Monika Heinkelein, Helga Heitzler, e Claudia Ladwig nel gruppo di citogenetica dell’Istituto di genetica umana di Friburgo per la loro consulenza e assistenza sperimentale. Ringraziamo anche Ekkehart Lausch, Elke Botzenhart, Susanne Munk-Schulenburg e Andreas Busche per la cura dei pazienti. Siamo grati ai pazienti e alle loro famiglie per la loro gentile collaborazione.

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Gli autori non hanno conflitti etici da rivelare.

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