Nel presente studio abbiamo esaminato l’effetto di un carico acuto di volume intravenoso di 0.9% salina, 3% salina e infusioni di glucosio isotonico su u-AQP2 e u-ENaCγ in uno studio randomizzato, crossover di soggetti sani. Lo scopo era quello di valutare l’attività di trasporto attraverso i canali dell’acqua aquaporina 2 e i canali epiteliali del sodio nelle cellule principali nella parte distale del nefrone.
Durante l’infusione e nel periodo immediatamente successivo, cambiamenti fisiologici adattativi hanno luogo nella funzione renale e negli ormoni vasoattivi. Pertanto, i principali cambiamenti nelle variabili di effetto potrebbero verificarsi dopo l’infusione. Nel presente studio, abbiamo prestato particolare attenzione ai cambiamenti nelle variabili di effetto nell’ultimo periodo post infusione (Post infusione 210-240), cioè 60-90 minuti dopo che l’infusione era cessata. Durante questo periodo, u-AQP2 è aumentato dopo l’infusione di soluzione salina ipertonica e isotonica ed è diminuito dopo l’infusione di glucosio. Allo stesso tempo, u-ENaCγ è aumentato dopo l’infusione di soluzione salina ipertonica ed è rimasto invariato dopo l’infusione di soluzione salina isotonica e glucosio.
U-AQP2 dopo l’infusione con soluzione salina ipotonica e isotonica e glucosio isotonico
Aquaporina-2 (AQP2) si trova nelle cellule principali del dotto collettore ed è espresso nella membrana plasmatica apicale. La vasopressina (AVP) regola l’AQP2 legandosi ai recettori V2 nella membrana basolaterale. L’esposizione a breve termine ad AVP causa il traffico e l’inserimento delle vescicole intracellulari, contenenti AQP2, alla membrana apicale e aumenta la permeabilità e l’assorbimento dell’acqua. La regolazione a lungo termine si verifica in un periodo da ore a giorni, ed è causata dalla trascrizione genica regolata da AVP con conseguente aumento dell’abbondanza di AQP2 in tutta la cellula. Esperimenti nei ratti hanno dimostrato che l’infusione di dDAVP ha aumentato u-AQP2 . Questo è coerente con l’idea che l’aumento della consegna dei canali AQP2 alla membrana apicale si traduce in una maggiore escrezione di AQP2 dopo la stimolazione con AVP. Circa il 3% di AQP2 nel condotto di raccolta sono escreti nelle urine, ma i meccanismi sottostanti sono sconosciuti.
L’espansione del volume con soluzione salina ipertonica al 3% aumenta l’osmolarità del plasma oltre la soglia degli osmorecettori ipotalamici, innescando il rilascio di AVP e un conseguente aumento di u-AQP2. Saito et al hanno trovato una relazione significativa tra l’escrezione urinaria di AQP2 e p-AVP in soggetti sani dopo l’infusione di soluzione salina ipertonica al 5%. Pedersen et al hanno trovato una correlazione positiva tra u-AQP2 e p-AVP durante 24 ore di privazione dell’acqua e dopo infusione di soluzione salina ipertonica al 3%. Pertanto, studi precedenti negli esseri umani hanno dimostrato che l’attività dei canali dell’acqua AQP2 può essere determinata misurando u-AQP2 . Sorprendentemente, Baumgartner et al non hanno trovato alcun cambiamento in u-AQP2 dopo l’infusione di 2,5% NaCl in volontari sani, nonostante un aumento significativo dell’osmolarità delle urine e AVP. Tuttavia, il carico d’acqua orale era 3-4 volte superiore prima dell’infusione rispetto al nostro studio. Quindi, il grande carico di acqua prima dell’infusione potrebbe aver annullato gli effetti stimolatori della soluzione salina ipertonica. Come previsto, il nostro studio ha mostrato che u-AQP2 è aumentato dopo il 3% di NaCl con un corrispondente aumento dell’osmolarità delle urine e una riduzione di CH2O. Pertanto, i nostri risultati indicano un aumento del riassorbimento dell’acqua attraverso i canali dell’acqua aquaporin-2 nei tubuli distali. Prima dell’aumento di u-AQP2, c’è stato un brusco aumento di p-osm e p-AVP indotto dall’infusione salina ipertonica. Gli studi sugli animali hanno dimostrato che l’ipertonicità può causare un aumento della regolazione dell’espressione di AQP2 nella membrana apicale paragonabile a quella ottenuta con il solo AVP. Non si può escludere che questo possa avere un ruolo attivo nell’aumento dell’escrezione di u-AQP2. Molto probabilmente, l’aumento del riassorbimento dell’acqua è stato mediato da un aumento di p-AVP. U-AQP2 ha continuato a salire per tutto il giorno dell’esame, suggerendo che i canali AQP2 sono rimasti inseriti e attivi nella membrana apicale a causa delle azioni di p-AVP elevata.
L’infusione di soluzione salina isotonica deprime il riassorbimento frazionale di acqua e sale nei tubuli prossimali negli animali. Nel presente studio, l’infusione di NaCl 0,9% ha causato la stessa risposta in u-AQP2, u-osm e CH2O dell’infusione di NaCl 3%, anche se in misura minore. C’è stato un piccolo aumento in p-osm ad un livello massimo di 286 mosmol/kg corrispondente ad un aumento dello 0,5%. Questo aumento è al di sotto della soglia dell’osmorecettore, e non abbiamo visto, né ci aspettiamo, alcun cambiamento significativo in p-AVP. Pertanto AVP non potrebbe essere il principale regolatore di AQP2 durante il NaCl 0,9%. Molto probabilmente, l’aumento del trasporto d’acqua tramite AQP2 è un fenomeno di compensazione per antagonizzare una diminuzione dell’assorbimento renale di acqua nei tubuli prossimali, che si verifica dopo l’espansione isotonica del volume. Il meccanismo potrebbe essere dovuto a un aumento dell’attività del sistema dei peptidi natriuretici.
L’infusione di glucosio al 5% provoca un’espansione di volume distribuita in tutte le fasi fluide del corpo con solo un aumento molto piccolo del volume plasmatico. Questo è illustrato nelle misurazioni dell’albumina plasmatica, dove le concentrazioni a 240 min erano praticamente uguali al basale (Tabella 4), indicando nessun cambiamento nel fluido extracellulare. Secondo le nostre conoscenze, nessuno studio ha misurato u-AQP2 dopo l’infusione di glucosio. Uno studio su soggetti sani ha mostrato che dopo un carico orale di acqua di 20 mL/kg per 15 minuti (assunzione media di 1605 ml) l’u-AQP2 è diminuita del 17% dopo 210 minuti. In uno studio recente, i soggetti hanno ricevuto un carico d’acqua orale di 20 ml/kg per 15 minuti (assunzione media di 1389 ml) con una successiva diminuzione del 27% di u-AQP2 dopo 240 minuti. Sia l’osmolarità del plasma che la p-AVP sono diminuite. Così, è stato dimostrato che u-AQP2 è ridotto durante la diuresi idrica dopo l’assunzione orale di acqua.
Nel nostro studio, i soggetti hanno ricevuto una media di 1736 ml di glucosio IV. Nell’ultimo periodo post infusione si è verificata la risposta acquaretica prevista, con una diminuzione del 16% di u-AQP2cr, una diminuzione di u-osm e un aumento di UO e CH2O. L’osmolarità plasmatica è diminuita da 285 mosm/kg a 280 m0sm/kg, cioè un calo del 2%, ma senza alcuna riduzione di accompagnamento in p-AVP. I nostri risultati indicano un ridotto riassorbimento di acqua attraverso i canali dell’acqua aquaporin-2 nei tubuli distali dopo l’infusione di glucosio isotonico. La mancanza di cambiamenti nella p-AVP potrebbe essere spiegata in primo luogo dal fatto che i soggetti avevano ricevuto 1225 ml di carico d’acqua orale prima dell’inizio dell’infusione, e questo potrebbe aver soppresso l’AVP nei periodi basali precedenti. In secondo luogo, le misurazioni della concentrazione di p-AVP potrebbero non essere abbastanza sensibili per rilevare una piccola diminuzione. Il peptide Apelin, scoperto di recente, potrebbe anche giocare un ruolo. Apelin è colozalizzato con AVP nei neuroni magnocellulari dell’ipotalamo. In volontari sani di sesso maschile, la diminuzione dell’osmolarità del plasma mediante carico d’acqua ha ridotto modestamente la p-AVP, ma la p-Apelina è aumentata rapidamente. La regolazione di Apelin è opposta a quella di AVP e i dati suggeriscono che Apelin, come AVP può partecipare alla regolazione dell’omeostasi dell’acqua. Non abbiamo misurato p-Apelin, ma avrebbe potuto essere di interesse per indagare apelin plasma in parallelo con p-AVP in condizioni di espansioni di volume differenti.
Quindi, nell’ultimo periodo post-infusione, u-AQP2 aumentato approssimativamente nella stessa misura dopo infusioni saline ipertoniche e isotoniche, mentre una marcata caduta è stata vista dopo infusione di glucosio isotonico. Una possibile spiegazione del ritardo nei cambiamenti di u-AQP2 potrebbe essere che ci vogliono pochi minuti perché i cambiamenti di AVP agiscano sulla cellula principale, sia per l’inserimento o la rimozione di AQP2 dalla membrana apicale, ma ci vogliono diversi minuti prima che l’effetto si veda nell’escrezione di u-AQP2 nelle urine.
U-ENaCγ dopo infusione con soluzione salina ipotonica e isotonica e glucosio isotonico
Il trasporto del sodio attraverso il dotto collettore avviene attraverso il canale epiteliale del sodio ed è responsabile del riassorbimento del 3-5 % del sodio filtrato. ENaC è composto da tre subunità distinte: α, β e γ e localizzato alla membrana plasmatica apicale delle cellule principali. L’ENaC è un bersaglio dell’aldosterone che agisce sul recettore dei mineralocorticoidi. L’aldosterone aumenta il trasporto di sodio ridistribuendo le subunità ENaC da sedi intracellulari alla membrana apicale e alterando la trascrizione genica. Mentre l’azione dell’aldosterone si verifica nel corso di ore o giorni, un altro percorso sinergico coinvolge AVP. Nei dotti collettori corticali dei ratti, AVP si lega ai recettori V2, stimola il cAMP e aumenta il riassorbimento del sodio promuovendo il traffico e l’inserimento di ENaC nella membrana apicale, inducendo un rapido cambiamento nell’attività del canale. Studi recenti nell’uomo hanno dimostrato che AVP, attraverso i recettori V2, stimola il riassorbimento di sodio mediato da ENaC attraverso le cellule principali.
Frazioni di ENaC sono normalmente escrete nell’urina. Si suppone che la quantità di ENaC-frazioni rifletta l’attività del trasporto del sodio attraverso i canali epiteliali del sodio, proprio come u-AQP2 riflette lo stato funzionale dei canali dell’acqua AQP2. Recentemente, il nostro gruppo ha introdotto un nuovo metodo per valutare il riassorbimento del sodio nelle cellule principali dei tubuli distali. Lauridsen et al hanno dimostrato una correlazione significativa tra i cambiamenti nell’escrezione urinaria di sodio e i cambiamenti nell’escrezione urinaria della frazione beta (u-ENaCβ) negli esseri umani sani. Apparentemente, u-ENaCβ può essere utilizzato come un biomarcatore per il trasporto di sodio attraverso ENaC. Nel presente studio, abbiamo misurato la frazione gamma della proteina dei canali epiteliali del sodio per valutare la regolazione up-and-down dell’espressione di γ-ENaC e il trasporto di sodio attraverso ENaC come precedentemente riportato dal nostro gruppo.
Il simpatizzante sodio-cloruro (NCC) nei tubuli convoluti distali (DCT) è un’altra importante via di riassorbimento del sodio. Il riassorbimento del sodio nel DCT è essenziale per definire la quantità di consegna del sodio alle cellule principali nel dotto di raccolta. È ampiamente accettato che il DCT è regolato da Ang II e aldosterone. Gli studi hanno anche dimostrato che l’AVP elevato aumenta la fosforilazione del NCC e presumibilmente si traduce in un maggiore riassorbimento di sodio.
Studi sperimentali sugli animali hanno dimostrato che la soluzione salina isotonica e ipertonica IV ha ridotto il riassorbimento di sodio nei tubuli prossimali, e quindi aumentato la quantità di sodio nelle urine. Andersen LJ et al hanno studiato gli effetti della soluzione salina ipertonica e isotonica in soggetti sani con una dieta controllata. I soggetti hanno ricevuto un carico di sodio per via endovenosa di 25 ml/kg di soluzione salina isotonica o di 4,5 ml/kg di soluzione salina ipertonica al 3% per 90 minuti. L’escrezione urinaria di sodio è aumentata sia con la soluzione salina isotonica che con quella ipertonica, con una natriuresi dopo la soluzione salina ipertonica superiore a quella dopo la soluzione salina isotonica. Il sodio plasmatico e l’osmolarità del plasma sono aumentati sostanzialmente dopo la soluzione salina ipertonica, così come la p-AVP. Il nostro studio ha dimostrato che l’infusione di NaCl 3% ha aumentato u-ENaCγ, FENa, p-Osm, p-Na e p-AVP. Pertanto, i nostri risultati riflettono un aumento del riassorbimento di sodio attraverso ENaC nelle cellule principali, e inoltre hanno confermato i risultati di Andersen et al. L’aumento di u-ENaCγ potrebbe essere in parte spiegato da una notevole diminuzione dell’assorbimento renale di sodio prossimale nel nefrone, compensata e regolata da un aumento dell’assorbimento nella parte distale. Tuttavia, l’aumento di p-AVP visto subito dopo l’infusione di NaCl 3% potrebbe anche indicare che l’aumento di u-ENaCγ è causato da azioni di AVP. Un aumento del movimento del sodio dal lume alla cellula attraverso ENaC sarebbe teoricamente guidare la secrezione di potassio attraverso i canali ROMK . Sorprendentemente abbiamo misurato una caduta nell’escrezione di potassio nelle urine. Questo potrebbe controbilanciare un ruolo importante del trasporto di sodio mediato da ENaC. Se la NCC aumentasse il riassorbimento del sodio, sia per compensare una diminuzione del riassorbimento prossimale che a causa dell’elevata p-AVP, allora meno sodio sarebbe trasportato da ENaC e quindi la secrezione di potassio non avrebbe luogo. Un possibile ruolo di NCC dopo l’infusione con salina ipertonica è puramente speculativo come non abbiamo misurato l’attività di NCC. Forse non abbiamo visto l’effetto positivo sulla secrezione di potassio entro i nostri limiti di tempo. Tuttavia, il trasporto di potassio è complesso e i fattori che modulano il trasporto di potassio, come il flusso tubulare alterato e l’aldosterone, sono molti.
Dopo l’espansione di volume con salina isotonica la pressione oncotica è leggermente ridotta, il che porta a un immediato aumento del GFR e a un minore riassorbimento di acqua nel tubulo prossimale. Abbiamo misurato un piccolo aumento del GFR e della produzione di UO. L’escrezione di sodio è aumentata, ma u-ENaCγ, p-Na, p-osm e p-AVP sono rimasti invariati, quindi i risultati sono stati quelli che ci aspettavamo. Per quanto riguarda il NCC, non ci si aspetterebbe alcun cambiamento nel riassorbimento di sodio mediato dal NCC durante la soluzione salina isotonica.
Nessuno studio ha mai valutato u-ENaCγ durante la diuresi idrica. Nel nostro studio, abbiamo misurato una tendenza verso una riduzione di u-ENaCγ dopo l’infusione di glucosio che riflette una piccola riduzione del riassorbimento di sodio tramite ENaC nella cellula principale. Come accennato in precedenza, abbiamo misurato una caduta del 2% in p-osmolality dopo l’infusione di glucosio, che teoricamente dovrebbe innescare una diminuzione di AVP. Non abbiamo rilevato una caduta in p-AVP, presumibilmente a causa di un basso p-AVP causato dal carico di acqua orale in anticipo o il fatto che le misure di concentrazione p-AVP potrebbe non essere abbastanza sensibile per rilevare piccoli cambiamenti. Si potrebbe ipotizzare che la diminuzione di u-ENaCγ potrebbe essere dovuta a una mancanza di legame di AVP ai recettori V2 nella membrana basolaterale della cellula principale. La mancanza di stimoli AVP porta ad un aumento dell’endocitosi dei canali ENaC dalla superficie della membrana in vescicole di riciclo, diminuendo così il riassorbimento del sodio.
Quindi, nell’ultimo periodo post infusione u-ENaCγ è aumentato notevolmente dopo l’infusione di soluzione salina ipertonica, era approssimativamente allo stesso livello dopo la soluzione salina isotonica ed è diminuito o tendeva a diminuire in risposta all’infusione di glucosio. L’aumento di p-osm e p-AVP è stato visto immediatamente dopo l’arresto dell’infusione di NaCl 3%. Il ritardo e il livello costante di u-ENaCγ dopo la soluzione salina ipertonica potrebbe essere spiegato dal fatto che ci vogliono pochi minuti per aumentare il traffico dei depositi intracellulari dei canali ENaC nella membrana apicale ma diversi minuti per espellere ENaC nelle urine dopo la stimolazione con AVP.
Ormoni vasoattivi
Oltre all’AVP, il sistema renina-angiotensina-aldosterone (RAAS) è un regolatore chiave dell’escrezione renale di sodio e quindi del volume dei fluidi corporei. È noto che la deplezione di sodio attiva e che il carico cronico di sodio riduce il RAAS. Studi in vitro e in vivo hanno dimostrato che l’aldosterone stimola il recettore dei mineralocorticoidi ad un aumento della trascrizione dei geni che codificano le proteine coinvolte nel trasporto di sodio cioè ENaC e Na,K-ATPasi.
Numerosi studi sui cambiamenti di volume del sangue hanno dimostrato che i cambiamenti acuti sono associati a regolazioni inverse del sistema renina-angiotensina-aldosterone. Nel presente studio, l’espansione del volume con soluzione salina al 3% e allo 0,9% ha portato a una riduzione simile e significativa di PRC, p-AngII e Aldo coerente con un aumento del volume extracellulare. Questo è in accordo con gli studi precedenti.
Dopo l’infusione di glucosio, abbiamo misurato nessun cambiamento significativo in PRC, p-AngII o p-Aldo. Questo era previsto, poiché l’infusione di glucosio non provoca alcun cambiamento marcato nel volume extracellulare. Il nostro studio non è stato progettato per consentire eventuali effetti regolatori dell’aldosterone, poiché l’azione dell’aldosterone si verifica nel corso di ore o giorni. Quindi altri fattori devono essere implicati nella regolazione di ENaC.
Punti di forza e limitazioni
La forza principale di questo studio è stato il design come uno studio crossover randomizzato con un gruppo omogeneo di giovani uomini e donne sani. Le condizioni del test erano molto ben definite per quanto riguarda la dieta, il sodio e l’assunzione di liquidi. Pertanto, i risultati non sono confusi da un diverso equilibrio di sale o acqua. Questo studio ha esplorato solo gli effetti acuti dell’espansione di volume. Senza dubbio, avremmo potuto ottenere ulteriori informazioni sugli effetti a lungo termine dell’espansione di volume e sull’escrezione urinaria di AQP2 e ENaCγ se il periodo post infusione fosse stato più lungo. Inoltre, lo studio non era controllato con placebo, attraverso l’infusione di una quantità trascurabile di soluzione salina allo 0,9%. Questo avrebbe potuto distinguere gli effetti dell’espansione di volume dalla variabilità generale del riassorbimento di acqua e sale. In questo studio non è stato possibile eseguire misure di ANP. Avrebbe potuto dare un contributo positivo ai nostri risultati.