Effetto dell’estratto d’acqua di Atractylodes macrocephala Koidz somministrato per via orale sulla risposta infiammatoria dei macrofagi e delle cellule T nei topi

Abstract

Il rizoma di Atractylodes macrocephala Koidz (AM) è un costituente di varie ricette di composti di richiamo del Qi. Abbiamo valutato le risposte infiammatorie nei macrofagi e nelle cellule T isolate dai topi dopo la somministrazione orale dell’estratto acquoso di AM (AME). Le cellule dell’essudato peritoneale sono state isolate da topi iniettati con tioglicolato e sono state esaminate le alterazioni dei recettori scavenger. I macrofagi peritoneali sono stati stimolati con lipopolisaccaridi (LPS). Sono state valutate anche le risposte delle citochine del siero all’iniezione intraperitoneale di LPS. Gli splenociti sono stati isolati e sono state misurate la loro composizione e le loro risposte funzionali. Il contenuto di atractylenolide I e atractylenolide III, noti ingredienti antinfiammatori, in AME era 0,0338 mg/g estratto e 0,565 mg/g estratto, rispettivamente. L’AME ha aumentato il numero di cellule SRA(+)CD11b(+) in risposta al tioglicolato. I macrofagi peritoneali isolati dal gruppo AME non hanno mostrato cambiamenti nei marcatori infiammatori come il fattore di necrosi tumorale (TNF-) α, l’interleuchina (IL-) 6, l’ossido nitrico sintasi inducibile e la cicloossigenasi-2, ma hanno mostrato una diminuzione dell’espressione CD86. È interessante notare che AME ha diminuito i livelli sierici di TNF-α e IL-6 su iniezione intraperitoneale di LPS. Per quanto riguarda il sistema immunitario adattativo, AME ha aumentato la popolazione di cellule T CD4(+) e l’espressione della molecola di classe II del complesso maggiore di istocompatibilità nella milza, e gli splenociti in coltura del gruppo AME hanno mostrato una maggiore produzione di IL-4 in concomitanza con una diminuzione della produzione di interferone-γ durante l’attivazione delle cellule T. AME ha promosso la ricostituzione dei macrofagi peritoneali durante la risposta infiammatoria, ma la sua attività antinfiammatoria non sembra essere mediata dalla modulazione dell’attività dei macrofagi. AME ha anche alterato lo stato immunitario delle cellule T CD4, promuovendo la risposta Th2.

1. Introduzione

L’infiammazione è una risposta protettiva per eliminare gli stimoli dannosi, e le cellule immunitarie sono i principali partecipanti a questo processo. A seconda della modalità di riconoscimento dell’antigene e della capacità di generare una risposta di memoria, le cellule immunitarie si dividono in sistema immunitario innato e sistema immunitario adattativo. Le cellule immunitarie innate come i macrofagi e le cellule dendritiche reagiscono istantaneamente all’antigene con una limitata specificità del recettore. Le cellule immunitarie adattative, costituite da cellule T e cellule B, sono antigene-specifiche, iniziano una risposta all’antigene che è entrato nel tessuto linfoide periferico e generano una risposta di memoria. Le cellule immunitarie innate sono gli attori principali nelle prime fasi dell’infiammazione, ma con il tempo, le cellule immunitarie adattative prendono il sopravvento.

I macrofagi residenti nel tessuto svolgono un ruolo chiave nell’immunità e nell’integrità dei tessuti. La maggior parte dei macrofagi tissutali derivano da precursori embrionali. In condizioni stazionarie le loro popolazioni sono mantenute attraverso la loro longevità e la proliferazione locale, e alcuni macrofagi sono reintegrati dalle cellule derivate dai monociti del sangue. Durante l’infiammazione, i monociti derivati dal midollo osseo vengono reclutati nel sito e si differenziano in macrofagi. I macrofagi eliminano gli agenti patogeni e gli antigeni attraverso la fagocitosi e inducono risposte infiammatorie producendo citochine ed enzimi come il fattore di necrosi tumorale (TNF) α, l’interleuchina (IL) 6, l’ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS) e la cicloossigenasi (COX) 2. Inoltre, i macrofagi sono un tipo di cellule professionali che presentano l’antigene (APC) che presentano gli antigeni alle cellule T.

Le cellule T, che consistono principalmente in cellule T CD4 e cellule T CD8, sono attivate quando i recettori delle cellule T (TCR) contattano i peptidi antigenici legati dalle molecole del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) sulle APC. Le cellule T CD4, che rappresentano più di due terzi delle cellule T, possono essere differenziate in varie cellule T helper (Th) effettrici come Th1, Th2, Th17, T helper follicolari e cellule T regolatrici. Tra questi sottoinsiemi, le cellule Th1 e Th2 sono stati i primi tipi ad essere definiti. Le cellule Th1 secernono alti livelli di interferone (IFN-) γ e sono efficienti nella difesa contro i patogeni intracellulari attivando i macrofagi, mentre le cellule Th2 secernono interleuchina (IL-) 4, IL-5 e IL-13 e proteggono l’ospite dalle infezioni da elminti reclutando eosinofili e mastociti. Anche se queste cellule T helper sono importanti per la difesa dell’ospite, l’attivazione cronica di qualsiasi tipo di cellule Th può causare disturbi immunomediati. Le cellule Th1 giocano un ruolo critico nell’autoimmunità organo-specifica e nei disturbi infiammatori cronici, mentre le cellule Th2 sono responsabili dell’infiammazione allergica.

Il rizoma di Atractylodes macrocephala Koidz (AM), appartenente alle Compositae, è stato utilizzato per il trattamento dei difetti funzionali del sistema digestivo come la perdita di appetito, la distensione addominale e la diarrea. Secondo la medicina tradizionale cinese, l’AM rinvigorisce il Qi risolvendo la ritenzione anomala di liquidi nel tratto gastrointestinale. L’AM è un componente di varie prescrizioni di composti per il potenziamento del Qi. Nella medicina tradizionale cinese, una delle funzioni essenziali del Qi è la difesa. Per questo motivo, si ritiene che le erbe che stimolano il Qi migliorino il sistema immunitario. Dato che le erbe potenziatrici del Qi vengono assunte in via preventiva per migliorare lo stato immunitario di individui senza difetti evidenti, è necessario valutare come il sistema immunitario possa essere alterato in individui normali in seguito alla somministrazione di AM. Nonostante il suo uso frequente, ci sono stati pochi studi per esplorare gli effetti di AM sul sistema immunitario.

AM contiene diversi sesquiterpenoidi bioattivi come atractylenolide I, atractylenolide II, e atractylenolide III e poliacetileni . Il trattamento in vitro dei macrofagi con atractylenolide I, atractylenolide III e alcuni composti poliacetilenici ha inibito l’espressione di TNF-α e iNOS indotta dal lipopolisaccaride (LPS-). La somministrazione orale di questi componenti liposolubili ha mostrato un’attività antinfiammatoria nei topi. Tuttavia, la maggior parte delle preparazioni tradizionali a base di erbe sono decotti a base di acqua, il che si traduce in un basso rendimento di componenti lipido-solubili farmacologicamente attivi. Inoltre, i poliacetileni possono essere facilmente distrutti in acqua bollente. Pertanto, abbiamo voluto affrontare se le risposte anti-infiammatorie si verificano in macrofagi isolati da topi dato AM estratto in acqua bollente (AME). Abbiamo anche esaminato l’effetto di AME sulla risposta infiammatoria del siero. Infine, abbiamo esaminato la composizione e la risposta funzionale degli splenociti per qualsiasi alterazione del sistema immunitario adattativo dopo l’integrazione di AME.

2. Materiali e metodi

2.1. Preparazione del campione

L’AME proveniente da Eusung (Corea del Sud) è stato acquistato da E-Pulip Co. (Lot. EPL1356-4) (Seoul, Corea del Sud). Un campione voucher (# 2013-AM) è stato depositato nel laboratorio di immunologia delle erbe, Kyung Hee University. In breve, 100 g di campione sono stati macinati, estratti con 1 L di acqua deionizzata (DW) in un apparecchio a riflusso e mantello riscaldante per 2 ore a 95°C, e filtrati attraverso carta da filtro Whatman numero 2 (Whatman International, Kent, Inghilterra). L’estratto è stato concentrato con un evaporatore rotante e liofilizzato sotto vuoto. La resa di AME è stata del 37,7%. Per l’analisi in cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), 0,4 g di AME sono stati sciolti in 10 ml di DW e sonicati per 5 minuti a 25°C. L’estratto è stato aggiunto all’acetato di etile, agitato per miscelare e lasciato riposare per 1 minuto. Lo strato superiore di acetato di etile è stato trasferito e questa procedura è stata ripetuta tre volte. Lo strato finale di acetato di etile è stato concentrato e liofilizzato.

2.2. I campioni sono stati analizzati da un sistema HPLC in fase inversa (Shimadzu 20A, Kyoto, Giappone) che consisteva in un autocampionatore (SIL-20A), una pompa binaria (LC-20AD) e un rivelatore a matrice di fotodiodi (SPD-20A) ed era dotato di una colonna YMC-Triart C18 (5 μm × 4,6 mm × 250 mm) (YMC, Kyoto, Giappone). I flussi di gradiente per il sistema a due solventi (solvente A, 0,05% di acido fosforico in acqua; solvente B, acetonitrile) erano i seguenti: 85% A/15% B a 0 min, 85% A/15% B a 5 min, 50% A/50% B a 15 min, 50% A/50% B a 20 min, 40% A/60% B a 25 min, 40% A/60% B a 30 min, 15% A/85% a 35 min, 15% A/85% a 40 min, 85% A/15% a 42 min, e 85% A/15% a 45 min. La velocità di flusso della fase mobile era di 1,0 ml/min con un volume di iniezione di 10 μl. La rilevazione è stata eseguita a 220 nm per l’atractylenolide III (Sigma, St. Louis, MO, USA) o a 280 nm per l’atractylenolide I (Sigma).

2.3. Animali

I topi Balb/c maschi di sette settimane sono stati ottenuti da SamTaco (Osan, Corea del Sud) e alloggiati in una struttura a temperatura e umidità controllata senza agenti patogeni con un ciclo luce-buio di 12 ore. Tutti gli animali sono stati sottoposti a 1 settimana di adattamento prima degli esperimenti. Le dosi sono state determinate utilizzando un calcolo estrapolato dalla differenza di superficie corporea tra un topo e un uomo. La dose raccomandata di AM per un uomo adulto di 60 kg è di 8-24 g di pianta grezza al giorno o 3-9 g di estratto al giorno (sulla base della resa di estrazione in questo studio). La dose per il topo può essere determinata come segue: una dose umana equivalente di 50-150 mg/kg × 12,3 (il coefficiente di conversione) = una dose per topo di 615-1.845 mg/kg. Sulla base di questo intervallo di dosi, abbiamo scelto dosi di 500 mg/kg e 2.500 mg/kg per questo studio. Gli animali sono stati assegnati in modo casuale ai gruppi sperimentali. L’AME è stato somministrato per via orale una volta al giorno per 10 giorni. Non ci sono state differenze nel peso corporeo tra i gruppi durante il periodo sperimentale. Il protocollo animale è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l’Uso degli Animali della Kyung Hee University (KHUASP(SE)-15-012), e i topi sono stati curati secondo le specifiche del National Research Council for the Care and Use of Laboratory Animals (1996).

2.4. Preparazione dei macrofagi

Per l’isolamento dei macrofagi, i topi sono stati iniettati intraperitonealmente con 2 ml di tioglicolato sterile al 3,5% (BD, Sparks, MD, USA) 4 giorni prima del sacrificio. Alla fine dell’esperimento, i topi sono stati sacrificati per dislocazione cervicale e cellule di essudato peritoneale sono stati isolati asetticamente da lavaggio peritoneale con DMEM freddo (Hyclone, Logan, UT, USA) contenente 10% di siero fetale bovino (FBS; Hyclone) e 1% penicillina-streptomicina. Dopo la centrifugazione, le cellule sono state risospese e contate utilizzando un contatore di cellule TC20 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

2.5. Preparazione degli splenociti

Per l’isolamento degli splenociti, le milze sono state ottenute asetticamente alla fine dell’esperimento. Dopo la rottura della milza tra vetrini in RPMI 1640 (Hyclone) con 1% FBS e 1% penicillina-streptomicina, le cellule sono state filtrate attraverso un filtro cellulare da 70μm. Dopo la centrifugazione, i globuli rossi sono stati lisati usando il tampone lisante BD PharmLyse (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Le cellule sono state risospese in RPMI 1640 con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina e contati utilizzando un T20 Cell Counter.

2.6. Iniezione intraperitoneale di LPS

I topi sono stati iniettati intraperitonealmente con 1,3 mg/kg di LPS (sierotipo 055:B5, Sigma) alla fine dell’esperimento. Dopo 1 ora, i topi sono stati anestetizzati con etere e il sangue è stato raccolto tramite puntura cardiaca. Il siero è stato ottenuto e conservato a -20°C fino all’analisi.

2.7. Cultura cellulare

Le cellule dell’essudato peritoneale sono state piastrate in piastre da 6 pozzetti o piatti da 60 mm e incubate per una notte a 37°C. Dopo la rimozione delle cellule non aderenti, le cellule attaccate sono state stimolate con 100 ng/ml LPS per 24 ore. Gli splenociti sono stati placcati in piastre da 24 pozzetti e stimolati con 2 μg/ml di anticorpo anti-CD3 (BD Biosciences) per 48 ore. Il surnatante è stato raccolto per l’analisi delle citochine.

2.8. Le cellule sono state lavate due volte in tampone fosfato (PBS) e risospese a 1 × 106 cellule/ml nel tampone FACS (PBS/0,1% NaN3/1% FBS). Le cellule sono state bloccate con l’anticorpo anti-topo CD16/CD32 di ratto (BD Biosciences) a 4°C per 5 min e poi colorate con anti-topo SR-AI coniugato con fluoresceina, anti-topo LOX1 coniugato con PE (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), anti-topo CD36 coniugato con PE, CD11b coniugato con FITC, anti-CD11b coniugato con PE, CD86 coniugato con PE, CD4 coniugato con FITC, CD8a coniugato con PE, CD19 coniugato con FITC e IA/IE coniugato con FITC (BD Biosciences) (tutti gli anticorpi erano diluiti 1:100) per 30 minuti in ghiaccio al buio. Gli anticorpi di isotipo corrispondenti sono stati usati per mostrare il legame non specifico. Le cellule sono state lavate e risospese nel buffer FACS. Un totale di 10.000 eventi sono stati acquisiti su un citometro a flusso Navios (Beckman Coulter, La Brea, CA, USA), e i dati sono stati elaborati utilizzando il software Kaluza (Beckman Coulter).

2.9. Analisi delle citochine

I livelli di TNF-α, IL-6, IFN-γ e IL-4 nei surnatanti e nei sieri sono stati determinati utilizzando i set BD OptEIA mouse ELISA (BD Biosciences) secondo il protocollo del produttore.

2.10. Saggio di proliferazione

I plenociti (4 × 105) in piastre a 96 pozzetti sono stati stimolati con mAb anti-CD3 solubile (2 μg/ml) per 48 ore. La proliferazione cellulare è stata determinata utilizzando il kit di saggio di proliferazione cellulare CellTiter96 One Solution (Promega, Madison, WI, USA).

2.11. Isolamento dell’RNA e PCR in tempo reale

L’RNA totale è stato isolato utilizzando un FavorPrep Total RNA Purification Kit (Favorgen Biotech, Pingtung, Taiwan), e il cDNA è stato invertito utilizzando un kit High Capacity RNA-to-cDNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Il cDNA diluito è stato mescolato con Power SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems) e 2 pmol di primer specifici per iNOS, COX2 o GAPDH. L’amplificazione del cDNA è stata eseguita utilizzando un sistema StepOnePlus real-time PCR (Applied Biosystems). Dopo la denaturazione termica iniziale a 95°C per 10 minuti, le condizioni di PCR sono state impostate a 95°C per 15 secondi e 60°C per 1 minuto per 40 cicli. Per ogni PCR, un campione corrispondente di mRNA senza trascrizione inversa è stato incluso come controllo negativo. La quantificazione del numero di copie di cDNA è stata ottenuta utilizzando una curva standard.

2.12. Analisi statistica

I dati sono stati presentati come errore standard della media (SEM). Il test t di Student a due facce o l’analisi della varianza a due vie sono stati applicati per confrontare le differenze tra i gruppi. Se l’analisi statistica ha mostrato che le differenze tra più gruppi erano significative, è stato utilizzato il test post hoc di Tukey per ulteriori confronti. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite con il software IBM SPSS 22.0 (IBM, Chicago, IL, USA). P-valori inferiori a 0,05 sono stati considerati significativi.

3. Risultati

3.1. Contenuto di Atractylenolide I e Atractylenolide III in AME

Tra i marker di controllo qualità noti, l’atractylenolide I e l’atractylenolide III sono composti antinfiammatori verificati in vitro. La frazione di acetato di etile da AME è stata identificata provvisoriamente usando un input spiked di standard autentici con il confronto dei tempi di ritenzione e dei modelli spettrali UV-visibili. I cromatogrammi HPLC sono mostrati nella Figura 1. Il contenuto di atractylenolide I e atractylenolide III in AME era 0,0338 mg/g estratto e 0,565 mg/g estratto, rispettivamente.

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Figura 1

Cromatogrammi HPLC di Atractylodes macrocephala estratto acquoso (AME). (a, b) Marcatori standard. (c, d) AME.

3.2. Effetto della somministrazione orale di AME sull’espressione del recettore Scavenger nelle cellule dell’essudato peritoneale del topo

L’iniezione intraperitoneale di tioglicolato è comunemente usata per indurre la peritonite sterile e arricchire i macrofagi peritoneali dei topi nei laboratori. La maggior parte dei macrofagi peritoneali sono derivati dai monociti del sangue. Abbiamo raccolto cellule di essudato peritoneale da topi trattati con AME utilizzando questo metodo. CD11b è stato utilizzato come marcatore per i macrofagi. I recettori Scavenger come SRA, CD36, e LOX-1 sono upregolati durante la differenziazione da monociti a macrofagi; quindi abbiamo esaminato l’espressione di queste proteine. SRA, CD36 e LOX-1 erano quasi esclusivamente espressi nelle cellule CD11b(+) (Figure 2(a)-2(c)). La percentuale di cellule SRA(+)CD11b(+) nel gruppo di controllo era del 66%, e il trattamento con 500 mg/kg e 2.500 mg/kg AME ha aumentato significativamente questa popolazione al 69% e 76%, rispettivamente. Le frequenze delle popolazioni di cellule CD36(+)CD11b(+) e LOX-1(+)CD11b(+) nel gruppo di controllo erano rispettivamente del 95% e del 14%, e l’AME non ha indotto cambiamenti significativi in entrambe le popolazioni. L’aumento della popolazione cellulare SRA(+)CD11b(+) indica che AME può stimolare la differenziazione dei monociti del sangue in macrofagi in risposta al tioglicolato.

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Figura 2

Recettori scavenger espressi dalle cellule dell’essudato peritoneale dopo somministrazione orale di AME. Ai topi è stato somministrato per via orale AME (500 o 2500 mg/kg) per 10 giorni. Le cellule dell’essudato peritoneale sono state isolate da topi iniettati con tioglicolato e doppiamente colorate con FITC-coniugato anti-SRA e PE-coniugato anti-CD11b Abs (a), FITC-coniugato anti-CD11b e PE-coniugato anti-CD36 Abs (b), o FITC-coniugato anti-CD11b e PE-coniugato anti-LOX-1 Abs (c). Le cellule sono state analizzate utilizzando la citometria a flusso e sono mostrati i dot plot rappresentativi. (d) Le barre rappresentano la media ± SEM (n=6). P <0.05, P<0.005 rispetto al controllo.

3.3. Effetto della somministrazione orale di AME sull’espressione superficiale di CD86 nei macrofagi stimolati da LPS

Molecole stimolatorie come CD86 sui macrofagi sono necessarie per rafforzare il crosstalk tra macrofagi e cellule Th. I macrofagi peritoneali isolati da topi trattati con AME sono stati stimolati con LPS per 24 ore e l’espressione di membrana di CD86 è stata misurata utilizzando la citometria a flusso. La stimolazione con LPS ha aumentato l’intensità di fluorescenza media di CD86 da 5,24 a 11,24 (Figura 3). L’intensità media di fluorescenza di CD86 nei gruppi 500 e 2.500 mg/kg è diminuita significativamente a 10,14 e 10,59, rispettivamente. Questi risultati indicano che AME può influenzare l’interazione tra macrofagi e cellule Th.

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Figura 3

Effetto di AME sull’espressione superficiale delle molecole costimolatorie in LPS-stimolati macrofagi. Macrofagi peritoneali isolati dai gruppi di controllo e AME sono stati stimolati con 100 ng/ml LPS per 24 h e poi colorati con anticorpo anti-CD86 coniugato PE. (a) Sono mostrati istogrammi rappresentativi. (b) Le barre rappresentano la media ± SEM (n=6). (-): senza LPS, (+): Trattamento LPS. MFI: intensità di fluorescenza media. # P<0,005 rispetto al controllo (-), P<0,05 rispetto al controllo (+).

3.4. Effetti della somministrazione orale di AME sulla risposta infiammatoria delle citochine nei macrofagi e nel siero

Prima abbiamo esaminato se la somministrazione orale di AME influenza la risposta infiammatoria dei macrofagi. I macrofagi peritoneali del gruppo di controllo o del gruppo AME ad alto dosaggio sono stati stimolati con LPS per 24 ore ed è stata misurata la produzione di TNF-α e IL-6 nel surnatante. Non c’è stata alcuna differenza nel livello di secrezione di TNF-α tra i gruppi di controllo e AME, ma il livello di IL-6 è aumentato nel gruppo AME (Figura 4(a)). Abbiamo anche scoperto che AME non ha indotto alcuna alterazione nell’espressione genica di iNOS e COX-2 nelle cellule stimolate con LPS (Figura 4(b)). Successivamente, abbiamo esaminato la risposta sistemica dei topi trattati con AME alla stimolazione intraperitoneale LPS. AME ha diminuito i livelli sierici di TNF-α e IL-6 del 20% e 47%, rispettivamente (Figura 5). Questi risultati indicano che l’attività antinfiammatoria di AME può verificarsi indipendentemente dalla modulazione dei macrofagi.

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Figura 4

Effetto di AME su citochine infiammatorie ed enzimi in LPS-stimolati macrofagi. I macrofagi isolati dal controllo o dal gruppo AME (2500 mg/kg) sono stati stimolati con LPS (100 ng/ml) per 24 ore. (a) I livelli di fattore di necrosi tumorale- (TNF-) α e interleuchina- (IL-) 6 nel surnatante sono stati determinati da ELISA. (b) La PCR quantitativa è stata usata per misurare l’espressione dei geni iNOS e COX-2. L’espressione del gene target è stata normalizzata all’espressione di GAPDH. I dati rappresentano la media ± SEM (n=6). (-): senza LPS, (+): Trattamento LPS. # P<0.005 rispetto al controllo (-), P<0.05 rispetto al controllo (+).

Figura 5

Effetti della somministrazione orale di AME sulle risposte infiammatorie del siero dopo l’iniezione intraperitoneale di LPS. AME (2500 mg/kg) è stato somministrato per via orale ai topi per 10 giorni. Il siero è stato ottenuto 1 ora dopo l’iniezione intraperitoneale di LPS (1,3 mg/kg) e i livelli sierici di TNF-α e IL-6 sono stati determinati tramite ELISA. I dati rappresentano la media ± SEM (n=10). (-): senza LPS, (+): Trattamento LPS. # P<0,001 rispetto al controllo (-), P <0,05, P <0,001 rispetto al controllo (+).

3.5. Effetti della somministrazione orale di AME sulle popolazioni di cellule T e B spleniche e sull’espressione di MHC II

Per determinare se la somministrazione orale di AME altera le cellule immunitarie adattative, abbiamo analizzato le percentuali di cellule T CD4 e CD8 spleniche e le cellule B nei gruppi di controllo e AME. La popolazione di cellule T CD4(+) è aumentata significativamente da 23.4% a 27.2% e 26.9% nei gruppi 500 e 2.500 mg/kg, rispettivamente (Figure 6(a) e 6(d)). Non sono state osservate differenze nelle popolazioni di cellule T CD8 e di cellule B (Figure 6(a), 6(b) e 6(d)). Le molecole MHC di classe II sono necessarie per la presentazione degli antigeni alle cellule T CD4. Abbiamo analizzato l’espressione splenica del topo MHC classe II molecole IA / IE e trovato che l’intensità media di fluorescenza delle molecole MHC II significativamente aumentato da 65,3 a 68,9 nel gruppo 2.500 mg/kg AME (figure 6 (c) e 6 (e)). Questi risultati suggeriscono che AME induce alterazioni nel sistema immunitario adattativo.

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Figura 6

Effetti della somministrazione orale di AME sulla composizione del sistema immunitario adattativo nella milza. Gli splenociti sono stati isolati da gruppi di controllo o AME e doppiamente colorati con anticorpo anti-CD4 coniugato FITC e anticorpo anti-CD8 coniugato PE (a), anticorpo anti-CD19 coniugato FITC (b), o anticorpo anti-MHC II coniugato FITC (c) e valutati con citometria a flusso. (a-c) Sono mostrati dot blot o istogrammi rappresentativi. (d-e) Le barre rappresentano la media±SEM (n=6). P <0,001 rispetto al controllo.

3.6. Effetti della somministrazione orale di AME sulla proliferazione delle cellule T e sulla risposta delle citochine Th1/Th2 negli splenociti

Abbiamo studiato la funzione delle cellule T spleniche dopo il trattamento con AME. Gli splenociti isolati da gruppi di controllo o AME sono stati stimolati con l’anticorpo anti-CD3, un mitogeno che attiva l’intera popolazione di cellule T indipendentemente dalla specificità del recettore dell’antigene. Il trattamento con l’anticorpo anti-CD3 per 48 ore ha aumentato la densità ottica di 2,6 volte come misurato dal saggio MTS. Non c’è stata alcuna differenza nella proliferazione indotta dall’anticorpo anti-CD3 tra i gruppi di controllo e AME (Figura 7(a)). IFN-γ e IL-4 sono citochine rappresentative per le cellule Th1 e Th2, rispettivamente. Abbiamo valutato la secrezione di IFN-γ e IL-4 negli splenociti stimolati con l’anticorpo anti-CD3. Una riduzione significativa della secrezione di IFN-γ è stata osservata nel gruppo AME 500 mg/kg, mentre la secrezione di IL-4 è stata significativamente aumentata nel gruppo 2.500 mg/kg (Figura 7(b)). Anche se non è stato osservato alcun effetto dose-dipendente, AME tendeva a promuovere la risposta Th2.

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Figura 7

Effetti di AME sulla proliferazione e la secrezione di citochine delle cellule T spleniche attivate. Gli splenociti isolati dai gruppi di controllo e AME sono stati coltivati e stimolati con l’anticorpo anti-CD3 (2 μg/ml) per 48 ore. (a) La risposta proliferativa degli splenociti è stata determinata usando il test MTS. (b) La secrezione di citochine a 48 ore dalla stimolazione è stata misurata tramite ELISA. Le barre rappresentano la media±SEM (n=6). (-): senza anticorpo anti-CD3, (+): trattamento con anticorpo anti-CD3. # P <0,001 rispetto al controllo (-), P <0,05 rispetto al controllo (+).

4. Discussione

Nella medicina tradizionale cinese, le erbe che potenziano il Qi dovrebbero migliorare il sistema immunitario. In questo studio, ci siamo concentrati specificamente sulle risposte infiammatorie dei macrofagi e delle cellule T isolate da topi a cui era stato somministrato per via orale AME.

La peritonite sterile indotta dal tioglicolato è stata introdotta per la prima volta nel 1964 da Gallily et al. e da allora è stato il metodo più comunemente usato per l’isolamento dei macrofagi primari. Il giorno 4 dopo l’iniezione intraperitoneale di tioglicolato, il numero totale di cellule dell’essudato peritoneale aumenta di circa 5 volte. Tra queste cellule, i macrofagi sono il tipo cellulare predominante, seguito dagli eosinofili. La fonte dell’aumentato numero di macrofagi peritoneali nei topi iniettati con tioglicolato è rappresentata dai monociti del sangue derivati dal midollo osseo. L’aumento dei recettori scavenger si verifica durante il processo di differenziazione dei monociti in macrofagi. I recettori scavenger, un tipo di recettori innati macrofagi, sono responsabili della fagocitosi e riconoscono specificamente ligandi polianionici. Abbiamo usato CD11b e diversi marcatori dei recettori scavenger per identificare i macrofagi derivati dai monociti nelle cellule dell’essudato peritoneale e abbiamo scoperto che la popolazione di cellule CD11b(+)SRA(+) era significativamente aumentata nel gruppo AME. Questo suggerisce che la somministrazione di AME promuove il reclutamento e la differenziazione dei monociti del sangue in macrofagi in risposta al tioglicolato.

LPS è riconosciuto dal complesso toll-like receptor (TLR)-4/MD-2. TLR4 induce risposte infiammatorie attraverso due molecole adattatrici, MyD88 e TRIF. La via di segnalazione MyD88-dipendente attiva NF-κB e la protein chinasi attivata da mitogeno (MAPK) per indurre geni infiammatori come TNF-α e IL-6. La via di segnalazione TRIF-dipendente attiva il fattore di regolazione dell’interferone-3 per produrre IFN-β, che è necessario per l’upregolazione delle molecole costimolatorie. La via di segnalazione TRIF partecipa anche all’attivazione di NF-κB e MAPK, ma in modo ritardato rispetto alla via MyD88-dipendente. L’aumento delle molecole costimolatorie è esclusivamente TRIF-dipendente, mentre le risposte infiammatorie sono co-dipendenti da MyD88 e TRIF. Non c’è stato alcun effetto inibitorio sui marcatori infiammatori testati nei macrofagi del gruppo AME. Invece, l’espressione di CD86 era diminuita. Il CD86 sui macrofagi lega il CD28 sulle cellule Th per rafforzare l’attività delle cellule Th. I nostri risultati indicano che la somministrazione orale di AME non influenza le risposte infiammatorie NF-κB- e MAPK-dipendenti nei macrofagi, ma interferisce specificamente con la via TRIF-dipendente che porta solo all’espressione CD86. Ulteriori studi sono necessari per valutare se AME provoca alterazioni in una situazione patologica in cui predominano macrofagi e cellule Th.

Il sistema di macrofagi stimolati con LPS è un modello in vitro molto comune per valutare l’attività antinfiammatoria di prodotti naturali o candidati farmaci. Usando questo modello, è facile ottenere il risultato desiderato con componenti lipidi-solubili perché possono facilmente penetrare la membrana cellulare. I nostri dati hanno mostrato che i macrofagi peritoneali isolati da topi a cui è stato somministrato per via orale AME non hanno mostrato effetti antinfiammatori ex vivo, contraddicendo i risultati in vitro precedentemente riportati. Al contrario, l’attività antinfiammatoria di AME è stata osservata nella risposta sierica di TNF-α e IL-6 su iniezione intraperitoneale di LPS. Questa attività antinfiammatoria sistemica è meno probabile che sia mediata dalla modulazione dei macrofagi. Una delle differenze tra le condizioni in vivo e in vitro è che l’LPS è trasportato nella circolazione da diverse lipoproteine e poi eliminato dagli epatociti in vivo, mentre questo evento non può essere imitato in vitro. La clearance dell’LPS può prevenire la sovrastimolazione dei macrofagi del fegato. Se l’attività antinfiammatoria sistemica dell’AME sia legata alla clearance del LPS nel fegato resta da determinare. Un risultato simile è stato ottenuto nei macrofagi peritoneali isolati da topi a cui è stato somministrato per via orale un estratto acquoso di Astragalus membranaceus (dati non pubblicati). Astragalus membranaceus e AM appartengono alla stessa categoria di erbe tonificanti del Qi. In questo momento, non sappiamo se l’attività antinfiammatoria in vivo che non coinvolge la modulazione dei macrofagi è unica per queste piante medicinali o una proprietà comune inducibile da piante medicinali Qi-tonificanti, e abbiamo bisogno di accumulare più dati per trarre qualsiasi conclusione. Inoltre, Li et al. hanno riferito che l’atractylenolide I e il 14-acetoxy-12-senecioyloxytetradeca-2E,8E,10E-trien-4,6-diyn-1-ol, un tipo di composto poliacetilenico isolato da AM, hanno una struttura molecolare che interagisce con il recettore dei glucocorticoidi legato alla membrana. Secondo il loro studio, 300 mg/kg di atractylenolide I orale e 30 mg/kg di poliacetilene orale erano le dosi minime necessarie per mostrare effetti antinfiammatori. La quantità di atractylenolide I in 2.500 mg/kg AME è solo 0,097 mg/kg, una dose molto al di sotto del minimo richiesto. Inoltre, la perdita di poliacetileni deve essere avvenuta durante la preparazione dell’AME. È possibile che l’AME contenga composti non identificati simili ai glucocorticoidi che contribuiscono alla sua attività antinfiammatoria sistemica.

Un numero sufficiente di cellule T è necessario per mantenere una risposta immunitaria adeguata. In condizioni normali, il numero totale di cellule T è mantenuto dalla generazione di cellule T naïve nel timo e dal turnover delle cellule T naïve periferiche e delle cellule T della memoria. I topi e gli esseri umani subiscono l’atrofia del timo con l’età e di conseguenza la produzione di cellule T naïve diminuisce in entrambe le specie. Tuttavia, in termini di mantenimento delle cellule T naïve, i topi producono cellule T naïve durante la loro vita, mentre gli esseri umani adulti mantengono questa popolazione attraverso la divisione delle cellule T naïve periferiche. Inoltre, la durata della vita delle cellule T naïve del topo è 40 volte più breve delle loro controparti umane. Le cellule T della memoria sono mantenute da una divisione intermittente. Il preciso meccanismo di sopravvivenza e proliferazione omeostatica delle cellule T naïve e della memoria non è completamente definito, ma coinvolge segnali dal complesso TCR/MHC e citochine come IL-7 e IL-15. L’effetto prolungato dei vaccini dipende dalle cellule T di memoria, mentre il trattamento delle condizioni linfopeniche richiede cellule T ingenue. Non abbiamo determinato se la popolazione di cellule T CD4 spleniche che è aumentata dopo il trattamento AME consisteva di cellule T CD4 ingenue o di cellule T CD4 di memoria. Una caratterizzazione dettagliata della frazione cellulare che risponde a AME aiuterà a specificare quale situazione è più adatta per l’applicazione di AME.

Da notare, upregulation concomitante di MHC classe II molecole nella milza si è verificato nel gruppo AME. Le molecole MHC di classe II sono necessarie per fornire antigeni alle cellule T CD4. Abbiamo trovato di routine che la maggior parte delle cellule che esprimono MHC di classe II nella milza sono cellule B e le cellule rimanenti sono macrofagi e cellule dendritiche. Non abbiamo chiarito quali tipi di cellule hanno mostrato l’upregulation delle molecole MHC di classe II dopo la somministrazione di AME. Tuttavia, gli aumenti sia del numero di cellule T CD4 che dell’espressione delle molecole MHC di classe II nella milza indicano che l’integrazione di AME contribuisce al mantenimento sistemico delle cellule T CD4. Il ruolo dell’IL-4 in condizioni fisiologiche è quello di migliorare la risposta anticorpale promuovendo la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule B e di fornire una difesa contro le infezioni da elminti. Gli splenociti dei gruppi AME hanno mostrato un aumento della produzione di IL-4 durante l’attivazione delle cellule T ex vivo in concomitanza con una diminuzione della produzione di IFN-γ. Questi risultati suggeriscono che in condizioni normali AME promuove la risposta Th2. Al contrario, la somministrazione orale di glicoproteina derivata da AM promuove la risposta Th1 mentre diminuisce la risposta Th2 in un modello allergico. Non è chiaro se questo composto rappresenta l’intera attività di AM. Sono necessari ulteriori studi per determinare se AME previene o aggrava le risposte Th2 patologiche.

5. Conclusione

In questo studio, abbiamo osservato cambiamenti nelle risposte dei macrofagi e delle cellule T in topi normali dopo la somministrazione orale di AME. AME ha migliorato la differenziazione dei monociti indotta dal tioglicolato nel peritoneo e ha soppresso i livelli di TNF-α e IL-6 indotti da LPS nel siero. A differenza di questi effetti antinfiammatori sistemici, gli effetti antinfiammatori non erano evidenti nei macrofagi isolati dal gruppo AME, ad eccezione delle alterazioni nell’espressione delle molecole costimolatorie. AME ha anche influenzato il sistema immunitario adattativo aumentando il numero di cellule T CD4 e l’espressione delle molecole MHC di classe II e promuovendo la risposta Th2 rispetto alla risposta Th1.

Abbreviazioni

AM:	Atractylodes macrocephala Koidz
AME:	AM estratto acquoso
LPS:	Lipopolisaccaride
TNF-α:	Fattore di necrosi tumorale-α
IL:	Interleuchina
APC:	Cella presentante l’antigene
TCR:	Ricettore delle cellule T
MHC:	Complesso maggiore di istocompatibilità
Cellula T:	Cellula T helper
DW:	Acqua deionizzata
FBS:	Serbo bovino fetale
PBS:	Salino fosfato tamponato
iNOS:	Inducible nitric oxide synthase
COX-2:	Cyclooxygenase-2
TLR:	Recettore simile al pollice
IFN-γ:	Interferone-γ
MAPK:	Mitogen-activated protein kinase.

Data Availability

I dati utilizzati per sostenere i risultati di questo studio sono disponibili dall’autore corrispondente su richiesta.

Conflitti di interesse

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata sostenuta dal Basic Science Research Program attraverso la National Research Foundation of Korea finanziata dal Ministero dell’Istruzione (2014R1A1A2055052).