Al fine di dimostrare l’uso di Escher-FBA per applicazioni reali, presentiamo quattro esempi chiave di FBA che possono essere eseguiti direttamente nel browser. Questi sono adattati da una revisione di FBA e delle sue applicazioni. Questi esempi si basano sul modello di base predefinito di E. coli, quindi sono pronti per essere implementati non appena la pagina web di Escher-FBA viene aperta. Assicurati di cliccare il pulsante Reset Map tra ogni esempio. Se hai problemi a trovare una reazione, clicca semplicemente sull’opzione Find nel menu View (o il tasto “f” sulla tua tastiera) per aprire una barra di ricerca.
FBA con substrati di carbonio alternativi
Il primo esempio dimostra l’uso di FBA per prevedere se la crescita può avvenire su substrati di carbonio alternativi. Il modello di base predefinito di E. coli include un mezzo minimo simulato con D-glucosio come fonte di carbonio. Qui, cambieremo la fonte di carbonio dal D-glucosio al succinato. Per prima cosa, posizionate il mouse sulla reazione di scambio del succinato EX_succ_e, e cambiate il limite inferiore a – 10 mmol/gDW/hr, trascinando il cursore o inserendo – 10 nel campo Lower Bound. Poi, posiziona il mouse sulla reazione di scambio del D-glucosio EX_glc_e, e alza il limite inferiore a 0 o clicca sul pulsante Knockout. L’obiettivo di default è ancora quello di massimizzare la crescita, quindi questi due cambiamenti istruiranno il programma a calcolare il tasso di crescita massima mentre usa il succinato come fonte di carbonio invece del D-glucosio. Si dovrebbe vedere che il tasso di crescita massimo previsto diminuisce da 0,874 h- 1 a 0,398 h- 1, riflettendo la minore resa di crescita di E. coli su succinato (Fig. 2a). Questo è l’approccio generale per apportare modifiche in Escher-FBA; passate il mouse sulla reazione, apportate le modifiche richieste, ed Escher-FBA mostrerà automaticamente i vostri risultati. I valori limite inferiori per lo scambio di fonti di carbonio rappresentano misure sperimentali, quindi puoi provare a regolare il valore limite inferiore specifico a valori realistici per la crescita su altre fonti di carbonio.
Esempi di simulazioni Escher-FBA. (a) Crescita simulata con succinato come unica fonte di carbonio. (b) Crescita anaerobica simulata su un terreno minimo di glucosio. (c) Massimizzazione del rendimento di ATP nel modello predefinito. (d) Crescita del modello iMM904 di S. cerevisiae. Si noti che la larghezza delle frecce è stata aumentata nel menu delle impostazioni per rendere i cambiamenti più evidenti
FBA durante la crescita anaerobica
La crescita anaerobica può essere simulata allo stesso modo passando il mouse sulla reazione EX_o2_e e cliccando Knockout o cambiando il limite inferiore a 0. Se cambiate lo scambio di ossigeno a zero mentre il succinato è ancora l’unica fonte di carbonio, l’indicatore Flux Through Objective mostra “Infeasible solution/Dead cell”, il che significa che la crescita non è possibile. Provate a cliccare il pulsante Reset nell’angolo in basso a destra per simulare un mezzo minimo con D-glucosio come fonte di carbonio, poi eliminate EX_o2_e, e il tasso di crescita previsto dovrebbe essere 0,211 h- 1 (Fig. 2b).
FBA con obiettivi composti
Escher-FBA supporta l’impostazione di obiettivi multipli nella modalità Obiettivi composti. Nel modello predefinito, l’impostazione di un nuovo obiettivo disabilita sempre l’obiettivo precedente. Per attivare la modalità, clicca prima sul pulsante Obiettivi Composti nella parte inferiore dello schermo. Come esempio di utilizzo della modalità: per controllare il tasso di crescita massimo minimizzando il flusso attraverso il SUCDi, iniziare con l’obiettivo predefinito di massimizzare la produzione di biomassa. Poi, passate il mouse sull’etichetta della reazione per SUCDi e cliccate sul pulsante Minimize all’interno del tooltip. In basso a destra, dovresti vedere entrambi gli obiettivi elencati. Notate che solo i coefficienti degli obiettivi di 1 o – 1 (rappresentati da Maximize e Minimize) sono attualmente supportati. Per tornare ai singoli obiettivi, basta cliccare nuovamente sul pulsante Compound Objectives.
Analisi dei rendimenti metabolici
Possiamo anche usare Escher-FBA per determinare i rendimenti massimi di precursori e cofattori come l’ATP. Tutto ciò che è richiesto è una reazione stechiometricamente bilanciata che consumi il cofattore di interesse. La reazione di mantenimento dell’ATP (ATPM) è uno di questi esempi. Per determinare la produzione massima di ATP, basta passare il mouse sulla reazione ATPM e cliccare sul pulsante Maximize. Impostare l’obiettivo in questo modo funziona perché, affinché il sistema massimizzi il flusso attraverso la reazione ATPM, deve prima produrre ATP nella massima quantità possibile. Quando ATPM è massimizzato nel modello predefinito di metabolismo del nucleo di E. coli, il valore dell’obiettivo è 175 mmol/gDW/hr. (Fig. 2c). Con il succinato come fonte di carbonio, questo valore diminuisce a 82,5 mmol/gDW/hr. Questa stessa procedura può essere seguita per qualsiasi metabolita di interesse creando una reazione di consumo stechiometricamente bilanciata e impostando il modello per massimizzare il flusso attraverso quella reazione. Si noti che attualmente non è possibile creare automaticamente una tale reazione in Escher-FBA, ma questo può essere aggiunto in una versione futura.
Analisi della variabilità del flusso
L’analisi delle soluzioni ottimali alternative nel metabolismo è un’altra utile applicazione di FBA. Poiché le soluzioni prodotte tramite FBA sono spesso non uniche, può essere utile conoscere la gamma di valori di flusso che una particolare reazione può avere. L’analisi della variabilità del flusso (FVA) è spesso utilizzata per calcolare questi intervalli attraverso l’intera rete. Escher-FBA non supporta direttamente i calcoli FVA, ma è possibile calcolarli per una data reazione. Per fare questo, prima passate il mouse sulla funzione obiettivo (la reazione biomassa Biomass_Ecoli_core_w_GAM) e impostate i limiti superiore e inferiore a un valore leggermente inferiore a quello del flusso corrente (nella mappa di default, provate 0,870). Poi, passa il mouse su una reazione di interesse e clicca sui pulsanti Maximize e Minimize per vedere il flusso massimo e minimo attraverso quella reazione dato il tasso di crescita ottimale. Per esempio, massimizzando e minimizzando il flusso attraverso GAPD nella glicolisi si ottiene un range di flusso fattibile di 15,44-16,68 mmol/gDW/hr, indicando che il flusso glicolitico è altamente vincolato a tassi di crescita elevati. D’altra parte, massimizzando e minimizzando il flusso attraverso il MALS nello shunt del gliossilato si ottiene un range di flusso fattibile di 0-2.64 mmol/gDW/hr., indicando che lo shunt del gliossilato può essere attivo o inattivo a tassi di crescita elevati. Questa procedura può essere fatta con qualsiasi serie di reazioni e l’utente può vincolare il suo sistema a qualsiasi numero di valori di flusso per vedere la gamma di soluzioni disponibili per una particolare reazione.
Utilizzando altri modelli su scala genomica
Il modello predefinito del nucleo di E. coli non è l’unico sistema che può essere simulato. Per esempio, se si desidera eseguire simulazioni su una cellula di lievito, un modello e una mappa per Saccharomyces cerevisiae possono essere scaricati da http://bigg.ucsd.edu/models/iMM904. In quella pagina, clicca sul pulsante di download per il modello (iMM904.json) e la mappa (iMM904.Central carbon metabolism.json). Caricale in Escher-FBA cliccando su Load Map JSON nel menu Map e Load Model JSON nel menu Model per caricare entrambi i file JSON. Una volta caricata, la mappa è pronta per essere modificata e simulata con qualsiasi strumento di Escher o Escher-FBA (Fig. 2d). Con un modello più grande come iMM904, non tutte le reazioni saranno visibili contemporaneamente, ma puoi aggiungere una reazione alla visualizzazione. Prima fai clic sull’icona della chiave inglese sulla barra laterale o seleziona Add reaction mode dal menu Edit. Ora, le reazioni possono essere aggiunte cliccando ovunque sulla mappa e selezionando la reazione desiderata dal menu a discesa. Il campo di inserimento del testo può essere usato per cercare una reazione di interesse.
Applicazione di Escher-FBA alla progettazione di una fabbrica di cellule microbiche
Per fornire un esempio di un’ipotesi di ricerca che può essere testata usando Escher-FBA, abbiamo caricato modelli su scala genomica di E. coli contenenti due percorsi per produrre 1-propanolo per la produzione chimica. Questi percorsi sono stati recentemente analizzati in uno studio sul potere predittivo dei modelli su scala di genoma per la simulazione di ceppi reali di fabbrica di cellule microbiche. Il primo modello include un singolo percorso per la produzione di 1-propanolo (file aggiuntivo 1) riportato per la prima volta da Atsumi et al. Il secondo modello include due percorsi sinergici per la produzione di 1-propanolo (file aggiuntivo 2) riportati per la prima volta da Shen e Liao. Ogni modello può essere caricato separatamente (con il modello > Load COBRA modello JSON pulsante del menu), e una singola mappa del metabolismo centrale è fornito che è compatibile con entrambi i modelli (file aggiuntivo 3, può essere caricato con Map > Load Map JSON). Pertanto, abbiamo caricato ogni modello individualmente, massimizzato l’escrezione di 1-propanolo (passando il mouse su EX_1poh_e e cliccando su Maximize), impostato il limite inferiore per l’escrezione al 99% del massimo, quindi minimizzato il flusso attraverso il primo passo impegnato della via del pentoso fosfato, glucosio 6-fosfato deidrogenasi (G6PDH2r). Le mappe risultanti dimostrano che le vie sinergiche per la produzione di 1-propanolo sono stechiometricamente bilanciate con la glicolisi, quindi non richiedono attività PPP (Fig. 3b). D’altra parte, il percorso individuale richiede un flusso significativo di PPP (Fig. 3a). Altre vie di utilizzo, come il flusso TCA necessario per ogni caso, possono anche essere esplorate su queste mappe.
Utilizzo delle vie per due vie eterologhe di produzione di 1-propanolo in E. coli. Il flusso della via del pentoso fosfato (PPP) necessario per ogni via di produzione eterologa può essere confrontato, in primo luogo, forzando la produzione di 1-propanolo al 99% del valore massimo (impostando il limite inferiore della reazione di scambio 1-propanolo) e, in secondo luogo, minimizzando il flusso attraverso il primo passo della PPP. (a) Il percorso dell’1-propanolo riportato da Atsumi et al. utilizza un unico percorso per ottenere la produzione di 1-propanolo. Richiede un flusso PPP significativo e ha una resa complessiva inferiore. (b) Il percorso riportato da Shen e Liao utilizza due percorsi in modo sinergico per ottenere un rendimento più elevato. Il percorso è stechiometricamente bilanciato con la glicolisi, quindi non richiede alcun flusso PPP
Mentre Escher-FBA può già essere utilizzato per molte simulazioni FBA direttamente nel browser web, un certo numero di esempi presentati da Orth et al. non può attualmente essere realizzato con Escher-FBA . Al momento, Escher-FBA non può eseguire funzioni come l’analisi di knockout del gene o l’analisi di robustezza. Tuttavia, Escher-FBA utilizza rappresentazioni SVG flessibili per gli elementi visivi, quindi l’analisi di robustezza e persino le caratteristiche grafiche come i piani di fase potrebbero essere aggiunte. Abbiamo stabilito una roadmap di sviluppo per Escher-FBA (disponibile dalla homepage https://sbrg.github.io/escher-fba) e un processo di sviluppo iterativo per consentire infine l’analisi di biologia dei sistemi complessi nel browser web.