Matrice extracellulare
Le interazioni tra le proteine della matrice extracellulare (ECM) e le cellule svolgono un ruolo importante nell’organizzazione citoscheletrica, nella crescita cellulare, nella migrazione cellulare e nello sviluppo dei tessuti (Zhong et al., 1998; Sternlicht e Werb, 2001; Stevens e George, 2005). L’ECM contiene molecole secrete che costituiscono il microambiente cellulare. I principali costituenti dell’ECM sono una rete di gel idrofili ed estesi di glicosaminoglicani (GAGs) e proteine fibrose, tra cui elastina, collageni, laminina e fibronectina, che si collegano attraverso domini di legame inter- e intra-molecolari specifici. I GAG, come il solfato di eparano, il solfato di condroitina e il solfato di cheratano sono polimeri carboidrati altamente gonfiati attaccati alle proteine ECM per formare proteoglicani. I GAG possono trattenere l’acqua tramite osmosi per mantenere i fattori di crescita, la ECM e le cellule idratate e attive. Le molecole GAG possono regolare una vasta gamma di attività biologiche, tra cui l’angiogenesi, i processi di sviluppo, la metastasi tumorale e la coagulazione del sangue (Kim et al., 2011). Per esempio, i collageni, la proteina più abbondante nella ECM, comprendono il 90% del contenuto proteico della matrice ossea. I collageni sono presenti nella ECM come proteine fibrillari e forniscono un’impalcatura strutturale per l’alloggio delle cellule. Strutturalmente, il collagene è assemblato dal procollagene, che è composto da tre eliche sinistre. Il procollagene fibroso è disposto a formare una struttura a superelica estesa con circa 1,5 nm di diametro e 300 nm di lunghezza. I procollageni possono auto-assemblarsi spontaneamente in vivo e in vitro in fibrille lunghe fino a diversi micron e larghe da 10 a 500 nm con una periodicità di 67 nm. Gli stati di aggregazione e la distribuzione spaziale dei collageni sono stati trovati per modulare lo sviluppo cellulare e la segnalazione attraverso il riconoscimento delle integrine (Hui et al., 2008; Huang et al., 2010a).
Le fibronectine sono glicoproteine che attaccano le cellule con le impalcature di collagene nella ECM, permettendo alle cellule di migrare attraverso la ECM. Pertanto, nell’organizzazione della struttura di base della rete ECM e nel controllo dei comportamenti cellulari, l’attaccamento delle fibronectine ai collageni è particolarmente cruciale (roekelmann et al., 1991; Dalton et al., 1995). Nelle ferite in via di guarigione, per esempio, i fibroblasti esprimono alti livelli di actina muscolare liscia, procollagene e fibronectina. È stato dimostrato che la fibronectina è un mediatore per l’attaccamento delle cellule al collagene. Quindi, l’adesione delle cellule all’ECM è importante per i successivi comportamenti di differenziazione e proliferazione (Ingber, 2003). Nell’ambiente in vitro, le cellule vengono seminate su superfici di coltura e presto possono adattarsi al loro ambiente secernendo proteine ECM adatte, come la fibronectina, per rimodellare le superfici per una migliore diffusione e adesione. Le interazioni intermolecolari nella ECM cambiano dinamicamente con le attività cellulari. Il complesso processo è legato all’ambiente di coltura, compreso il mezzo di coltura, le proteine adsorbite, il substrato sottostante e i tipi di cellule. È stato scoperto che livelli sufficienti di fibronectina sono necessari per l’adesione e la diffusione delle cellule su superfici depositate con collagene (Grinnell e Minter, 1978; Dewez et al., 1999). Inoltre, le proprietà di superficie dei substrati sottostanti dominano l’adesione delle proteine, portando a vari contenuti di superficie, conformazione e concentrazione delle proteine depositate. Va notato che i sistemi di coltura tradizionali, come il vetro e il polistirolo per colture tissutali, facilitando l’adsorbimento non specifico delle proteine, non sono in grado di indagare definitivamente le interazioni tra le cellule e un componente/proteina corrispondente nella ECM.
La maggior parte delle cellule di mammiferi possono solo crescere in vitro quando sono attaccate a superfici con deposito delle proteine ECM. L’ECM fornisce più di un supporto strutturale e meccanico, implicazioni nelle nicchie delle cellule staminali, nel patterning dello sviluppo e nel progresso del cancro. Le proprietà fisiche della ECM possono anche servire una posizione critica nel processo di segnalazione. Le strutture dell’ECM possono essere estensibili e flessibili, e le varie tensioni meccaniche possono imporre siti criptici, che potrebbero ulteriormente reagire con i loro recettori o fattori di crescita. Per quanto riguarda le proprietà meccaniche, l’ECM può possedere vari gradi di elasticità, e rigidità, dai tessuti ossei duri al cervello morbido, secondo le loro costituzioni, concentrazioni, e strutture di reticolazione. L’elasticità dell’ECM può spaziare su diversi ordini di grandezza, che ha dimostrato di svolgere un ruolo importante nel controllo di numerose funzioni cellulari, come la contrazione cellulare, la proliferazione cellulare, la migrazione, la differenziazione e la morte cellulare (Discher et al., 2005; Engler et al., 2006). Inoltre, è stato scoperto che le nanostrutture delle proteine ECM possono influenzare notevolmente le attività di una cellula (Koyama et al., 1996; Jones et al., 1997; Huang et al., 2010a). Il collagene di tipo I in natura forma spontaneamente una struttura ad elica. Dopo il trattamento con calore e acido, la struttura tridimensionale regolare del collagene viene distrutta (collagene denaturato o gelatina). Sorprendentemente, il collagene denaturato promuove una migliore diffusione e proliferazione cellulare delle cellule muscolari lisce (SMC) rispetto al collagene di tipo selvaggio (collagene nativo). Uno studio meccanicistico ha proposto che il collagene nativo sopprima la fosforilazione della chinasi 2 ciclina-dipendente (Cdk2) e della chinasi associata alla ciclina E mentre aumenta i livelli degli inibitori della Cdk2 p21Cip1/waf1 e p27Kip1 (Koyama et al., 1996). L’effetto sembrava controllare la crescita delle cellule staminali polmonari nel sistema di coltura primaria (Huang et al., 2010a). Il sistema includeva cellule dello stroma, cellule staminali polmonari e collagene di tipo I. Quando la dimensione fibrillare del collagene aumenta, la proliferazione e la diffusione delle cellule stromali mesenchimali diminuiscono, il che porta all’inibizione della crescita delle cellule polmonari primarie neonatali (Huang et al., 2010a). Pertanto, le cellule stromali mesenchimali servono come cellule di nicchia per regolare direttamente la capacità di rinnovamento delle cellule staminali epiteliali polmonari.
Biointerfacce funzionali dinamiche
Per comprendere meglio i meccanismi di riconoscimento e regolazione tra la ECM e le cellule, sono stati stabiliti diversi sistemi modello basati su monostrati auto-assemblati funzionali (SAM) (Roberts et al., 1998; Xiao et al., 1998; Rezania et al., 1999). I SAMs di alcanethiolati su superfici d’oro possono presentare miscele di arginina-glicina-aspartato (RGD), e moieties di oligo(etilenglicole) (OEG). RGD è un tripeptide, trovato per promuovere l’adesione cellulare legandosi ai recettori dell’integrina sulla superficie cellulare, e OEG è tipicamente usato per resistere all’adsorbimento non specifico di proteine e cellule. La frazione e le strutture dei tripeptidi RGD hanno permesso la manipolazione dei comportamenti di adesione cellulare. I sistemi hanno permesso di chiarire le complesse attività biologiche in una certa misura. Tuttavia, come menzionato sopra, le proprietà meccaniche e le interazioni molecolari tra i componenti ECM (cioè, fibronectina-collagene e GAG-collagene) nei microambienti possono determinare sostanzialmente le attività cellulari. Inoltre, i ligandi relativamente statici sulle superfici non possono riflettere le dinamiche nei contatti cellula-ECM.
A causa del fatto che la deposizione di proteine sulla superficie in modo casuale non riuscirà a definire la sua interazione con le cellule, è necessaria una piattaforma ben caratterizzata. Al fine di esaminare le attività cellulari nei tessuti, tale piattaforma dovrebbe esibire funzioni multiple, come la capacità di immobilizzare ligandi specifici, di prevenire attività cellulari fuorvianti indotte da proteine non bersaglio adsorbite, e di presentare una struttura estesa e idratata simile all’ECM. Così, le proprietà funzionalizzabili e non-fouling dei substrati diventano sostanziali come piattaforma per la crescita cellulare. Tra i molti materiali non-biofouling che possono resistere fortemente proteina non-specifica adsorbimento (Ishihara et al., 1998; Chen et al., 2010; Jiang e Cao, 2010), materiali a base di lipidi sono pensati per essere il migliore per i sistemi biologici perché creano una membrana cellulare-come microambiente per indagare cellula-cellula e cellule-biomateriale interazioni. In particolare, le complesse interazioni cellula-cellula e cellula-biomateriale sono altamente dinamiche con una vasta gamma di biomolecole in modo spazio-temporale controllato, come i complessi processi di segnalazione intracellulare e la riorganizzazione strutturale. Non possono essere condotti da sistemi SAM statici. Al fine di monitorare la complessità della membrana cellulare e dei processi associati in vitro, vengono sviluppati materiali sintetici dinamici in cui è possibile controllare le caratteristiche dei ligandi come la mobilità, la densità e la presentazione. Le membrane cellulari modello, i bilayer lipidici supportati (SLB), offrono un approccio bottom-up per costruire biointerfacce funzionali dinamiche per consentire l’auto-assemblaggio e la mobilità, la presentazione e la distribuzione dei ligandi in determinate posizioni (Kocer e Jonkheijm, 2018). Pertanto, l’attenzione di questo articolo si concentra sullo sviluppo di contatti cellula-ECM utilizzando SLBs funzionali per chiarire i complessi comportamenti dinamici per sfruttare le caratteristiche chiave delle membrane cellulari e le loro interazioni con ECMs. Sulla base delle SLB, gli studi hanno costruito una SLB funzionalizzata modificata con piccole molecole, come il peptide RGD (Svedhem et al., 2003; Jensen et al., 2004; Ochsenhirt et al., 2006) e il fattore di crescita epidermico (Nam et al., 2006) per i controlli sulle risposte cellulari. Tuttavia, per ampliare la portata e la complessità del microambiente, un sistema biomimetico costruito dalla coniugazione di proteine ECM a un SLB funzionalizzato può essere più applicabile per illustrare le interazioni tra i componenti ECM e le cellule. La fluidità, gradiente, proprietà meccaniche, nanostrutture, inter-molecolare (ad esempio, collagene-fibronectina) e intra-molecolare (ad esempio, collagene fibrillogenesi) interazioni di componenti ECM su SLBs può essere definito e valutato per esplorare le risposte cellulari reali nel microambiente, distinguendo così questo tipo di piattaforma di coltura cellulare da altri su solidi, come la plastica, metalli, ossidi, e SAMs. Pertanto, SLB offre una piattaforma robusta con proprietà uniche simili alla membrana cellulare, come il non-fouling, l’idratazione, la diffusione laterale, e la capacità di controllare la posizione spaziale e la densità dei ligandi per un grande potenziale nella scienza medica e nell’ingegneria (Sackmann, 1996; Groves et al, 2001).
Sistemi di bilayer lipidici supportati dalla matrice extracellulare
Il lavoro pionieristico del sistema di coltura cellulare biomimetico basato su un SLB coniugato con ECM è stato condotto dal gruppo di Chang (Huang et al., 2010b). Hanno costruito una piattaforma biomimetica funzionalizzando il collagene di tipo I su SLBs per servire come substrato per verificare la cultura cellulare e per studiare i comportamenti delle cellule, Le vescicole lipidiche funzionalizzabili composte da 1,2-dipalmitoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(glutaril) (DP-NGPE) e 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) sono stati depositati su un substrato SiO2 per formare SLBs (Figura 1). La frazione molare di DP-NGPE, un fosfolipide funzionalizzato con acido carbossilico, nelle SLBs è stata variata da 0 a 40%. Per creare il tipo I collagene-funzionalizzato assemblaggio del bilayer lipidico, le molecole di collagene nativo di tipo I sono state portate nella camera per reagire attivato DP-NGPE lipidi e per formare collagene stabile-lipidi coniugati con legami ammidici attraverso chimica di accoppiamento ammina. La cinetica di legame dell’immobilizzazione della proteina e le caratteristiche del film di spessore, viscoelasticità, conformazione e fluidità sono state monitorate usando una microbilancia a cristallo di quarzo con dissipazione (QCM-D), la microscopia a forza atomica (AFM) e il recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP). I risultati hanno mostrato che il collagene adsorbito su SLB funzionalizzati che avevano un’alta percentuale di DP-NGPE ha aumentato la loro massa superficiale, la viscoelasticità e l’autoassemblaggio in strutture fibrillari. I dati di FRAP hanno indicato che la mobilità laterale dei lipidi era ridotta fino al 20% dopo l’accoppiamento del collagene di tipo I alle SLB. Le cellule muscolari lisce (A10) si sono diffuse e sono cresciute sulla piattaforma funzionalizzata con il collagene in modo regolare, a differenza del bilayer POPC/DG-NGPE senza collagene e del bilayer lipidico POPC nudo. Il semplice sistema biomimetico bottoms-up, contenente costituenti chiave della membrana plasmatica e della ECM, offre l’opportunità di rivelare il riconoscimento cellulare e la risposta agli elementi della ECM e agli indizi fisici.
Figura 1. Illustrazione schematica della strategia mimetica di modifica del collagene basata sulle integrine in cellule di mammifero. (A) Nel microambiente in vivo le cellule attaccano le fibre di collagene tramite le integrine. (B) Per imitare il microambiente delle cellule, le fibre di collagene sono chimicamente modificate sul modello SLB. Le sfere blu simboleggiano i gruppi dirigenti POPC e i pentagoni oliva rappresentano i gruppi NHS-estere di DP-NGPE. Ristampato con il permesso di Huang et al. (2010b). Copyright 2010 American Chemical Society.
Oltre allo studio puntuale, le risposte cellulari evolutive sul sistema ECM-SLB sono state studiate dallo stesso gruppo (Huang et al., 2010c). Nello studio, i microambienti ECM biomimetici sono stati fabbricati coniugando collagene di tipo I e/o fibronectina sulle SLB funzionalizzabili contenenti DP-NGPE attivato (Figura 2). I sistemi coniugati con proteine sono stati caratterizzati quantitativamente da QCM-D in termini di massa superficiale, viscoelasticità e interazioni collagene-fibronectina. Il ritardo della mobilità della SLB dopo la coniugazione della proteina e la cultura cellulare sono stati rivelati da FRAP. I fibroblasti NIH 3T3 sono stati coltivati sui costrutti ECM-SLB e sul polistirolo trattato con plasma di ossigeno (PSo) per un confronto parallelo. Sulle colture ECM-SLB, il maggior numero di cellule e le dimensioni di diffusione dei fibroblasti sono state trovate sulle SLB depositate con fibronectina. Tuttavia, nessuna differenza distinguibile sul PSo rivestito di ECM può essere osservata tra tutti i contenuti proteici. Inoltre, i dati di colorazione immunofluorescente hanno indicato che il livello di adsorbimento della fibronectina, prodotta endogenamente dalle cellule 3T3, sulle superfici basate su PSo era ovviamente maggiore di quello sulle piattaforme basate su SLB. I risultati evidenziano il ruolo importante della natura anti-fouling delle SLB sottostanti nell’impedire alle cellule 3T3 di rimodellare efficacemente il loro microambiente. Al contrario, le cellule possono facilmente rimodellare attraverso l’adsorbimento non specifico delle proteine ECM sulle piattaforme basate su PSo. Di conseguenza, la piattaforma ECM-SLB può essere utilizzata per monitorare e regolare le risposte specifiche delle cellule alle composizioni ECM e ai successivi eventi di segnalazione con gli ambienti extracellulari.
Figura 2. Processi di fabbricazione di film funzionalizzati PSo- (A,C,E) e SLB-based (B,D,F) proteina adsorbito per indagare le risposte di NIH-3T3 fibroblasti. In terreno di coltura privo di siero, le cellule sono state incubate su sei tipi di superfici per 6 h. Ristampato con il permesso di Huang et al. (2010c) Copyright 2010 Elsevier Ltd.
Il gruppo di Cho ha esaminato il comportamento delle cellule su SLB a bassa rigidità funzionalizzato con fibronectina o collagene di tipo I tramite chimica di accoppiamento amminico (Vafaei et al., 2017a). Tradizionalmente, le piastre di plastica per colture cellulari esibiscono un substrato estremamente rigido, che non potrebbe riflettere la reale rigidità meccanica sperimentata dalle cellule nei microambienti fisiologici. Recentemente, gli elastomeri, come il polidimetilsilossano (PDMS), sono stati utilizzati per modulare ampi regimi di rigidità per fornire molte importanti intuizioni sul ruolo delle proprietà meccaniche della ECM nelle risposte cellulari (Engler et al., 2006). Tuttavia, i sistemi SLB offrono l’opportunità di accedere alle interfacce più morbide e fluide per monitorare le attività cellulari possono in un ambiente fisiologico. Le vescicole lipidiche composto da un zwitterionic 1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DOPC) e DP-NGPE, che poi sono stati depositati su coprioggetti SiO2 dal solvente assistita bilayer lipidico (SALB) formazione metodo (Tabaei et al., 2014; Vafaei et al., 2017b). Diverso dal metodo convenzionale di fusione delle vescicole, che comporta l’adsorbimento spontaneo e la rottura delle vescicole fosfolipidiche, ed è limitato solo a un sottoinsieme di composizioni lipidiche e supporti solidi (Huang et al., 2010a,b,c), il metodo di formazione SALB si basa sul fenomeno di evaporazione in fase inversa e comporta la deposizione di lipidi su una superficie solida idrofila in un alcol (Tabaei et al., 2014). Il metodo SALB è stato applicato con successo a una grande varietà di substrati, come Au, Al2O3, e grafene, che sono intrattabili al metodo convenzionale (Tabaei et al., 2014; Jackman et al., 2015). Le proteine ECM di tipo I collagene e fibronectina sono state coniugate chimicamente su SALB-assistito SLBs. Gli studi QCM-D sono stati condotti e hanno scoperto che le ECM su SLB sono meno dense e hanno una maggiore flessibilità strutturale rispetto a quando sono adsorbite su SiO2 (Vafaei et al., 2017b).
Inoltre, il substrato a bassa rigidità basato su SLB è stato funzionalizzato con collagene di tipo I o fibronectina per studi di adesione cellulare (Vafaei et al., 2017a). La fluidità laterale della SLB è stata finemente regolata controllando la frazione molare di DP-NGPE e colesterolo nella SLB. L’adesione specifica delle cellule sul bilayer, dalle immagini di fluorescenza, è stata indicata da un arricchimento delle proteine ECM e dalla comparsa di una zona di impoverimento intorno alle cellule. Sui bilayer ad alto contenuto di colesterolo, >10% delle cellule hanno mostrato un impoverimento di fibronectina o di collagene. Questo è attribuito al ridotto movimento laterale delle proteine ECM, che è controllato dalla viscosità del bilayer sottostante. Pertanto, la piattaforma ECM-SLB con aggiunta di colesterolo fornisce una gamma di rigidità del substrato per potenziali applicazioni biomediche che richiedono l’adesione delle cellule a superfici a bassissima rigidità come i tessuti neuronali.
Per lo sviluppo di una piattaforma che è più strettamente imitare il microambiente cellulare, un SLB è stato funzionalizzato con naturale matrice extracellulare decellularized (dECM), che mantengono 3D-ultrastruttura e sostenere la sopravvivenza e l’attaccamento di epatocita umano Huh 7.5 (Figura 3) (Vafaei et al, 2018). Il dECM è stato estratto da cadaveri di topo e sono stati decellularizzati utilizzando miscela di cloroformio/soluzione di metanolo. Il dECM contiene GAG, collagene e fibronectina. I componenti dECM sono stati attaccati chimicamente alla SLB contenente DP-NGPE e DOPC da chimica di accoppiamento ammina. QCM-D è stato utilizzato per monitorare la formazione del bilayer e la cinetica della successiva deposizione dECM. I risultati di FRAP hanno confermato la fluidità della membrana dopo la funzionalizzazione con dECM. La piattaforma supporta la sopravvivenza e l’attaccamento delle cellule, e mantiene la funzione epatocellulare rappresentativa. Sorprendentemente, il raggruppamento laterale e l’organizzazione dei recettori dei fattori di crescita e dei ligandi di legame cellulare in presenza di componenti dECM derivati dal tessuto con il ricco profilo biochimico sono stati osservati sulla piattaforma.
Figura 3. Schema dei vari passaggi coinvolti nella preparazione di SLB funzionalizzato con componenti dECM del tessuto adiposo per la cultura cellulare. La ECM decellularizzata derivata dal tessuto adiposo è stata solubilizzata in una condizione acida ed è stata attaccata chimicamente tramite chimica di accoppiamento amminico alla superficie di un bilayer supportato contenente lipidi con un gruppo di testa recante un gruppo acido carbossilico libero. Successivamente, le cellule sono state coltivate e il loro attaccamento, la diffusione, la crescita e la funzione sono stati studiati. Ristampato con il permesso di Vafaei et al. (2018). Copyright 2018 American Chemical Society.
Hao et al. hanno riportato l’effetto delle proprietà meccaniche di un ECM-SLB sulla differenziazione delle cellule staminali neurali (NSCs) (Hao et al., 2018). SLBs sono stati utilizzati per come una piattaforma di cultura per imitare le caratteristiche dinamiche della ECM fluida. La fluidità di SLBs è stata finemente variata dalle proprietà di superficie dei substrati. Le SLB contengono 1,2-dipalmitoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(7-nitro-2-1, 3-benzoxadiazol-4-yl) (NBD-PE), 1,2-dimyristoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), e 1,2-dipalmitoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(succinyl) (Succinyl-PE). Dalle misure FRAP, la SLB su vetro trattato con piranha (P-SLB) mostra una maggiore fluidità rispetto a quella su vetro modificato con colesterolo cloroformizzato (CC-SLB) o su vetro modificato con chitosano (Cs-SLB). Inoltre, la fluidità di CC-SLB era leggermente inferiore a quella di Cs-SLB. La fibronectina è stata successivamente adsorbita fisicamente sugli SLB su diversi substrati. I risultati hanno indicato che il comportamento delle NSC era altamente correlato alla fluidità delle SLB. Una maggiore adesione focale, una morfologia cellulare allungata e allungata, una fitta rete di fibre di stress e una maggiore differenziazione neuronale sono state osservate sulla SLB con bassa fluidità. Al contrario, una minore formazione di adesione focale, una morfologia cellulare rotonda, fibre di stress immature e una maggiore differenziazione degli astrociti sono state trovate sulla SLB con alta fluidità. Negli studi meccanicistici, hanno dimostrato che l’attivazione delle vie di segnalazione FAK-MEK/ERK è un percorso chiave per la formazione di adesione focale migliorata e infine ha promosso la differenziazione neuronale di NSCs sulla SLB con bassa fluidità. Il lavoro ha fornito informazioni sull’effetto della ECM dinamica sul comportamento delle cellule staminali e migliora l’efficacia delle applicazioni delle cellule staminali.
I liposomi legati su SLB sono stati stabiliti per l’ibridazione del DNA (Benkoski e Hook, 2005; Yoshina-Ishii et al., 2005), il legame biotina-streptavidina (Patel et al., 2009) e la consegna di farmaci (Tseng e Chang, 2012). I sistemi di liposomi legati sono stati applicati per la ricostituzione di proteine di membrana per studiare le interazioni proteina-lipide e proteina-proteina, così come l’incapsulamento di proteine per il rilevamento di singole biomolecole. Un costrutto biomimetico contenente ECM-SLBs è stato formato con polietilenglicole (PEG), fibronectina e liposomi contenenti colesterolo (Tseng e Chang, 2012). Gli SLB erano costituiti da 1,2-dipalmitoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamine-N-cap-biotinyl (b-PE) funzionale e POPC zwitterionico. I liposomi incapsulati nel farmaco sono stati immobilizzati dall’interazione biotina-streptavidina (Figura 4). Il costrutto liposoma-SLB serve come una piattaforma multifunzionale per il rilascio del farmaco e il fissaggio delle cellule. La formazione della fibronectina-liposoma-SLB piattaforma modello è stato monitorato in situ con QCM-D. L’eccellente stabilità dei liposomi legati alla superficie su SLBs è stata raggiunta tramite una sonda fluorescente incapsulata. Mostra che < il 20% del contenuto della sonda fluorescente è stato rilasciato in 8 giorni. Le cellule HeLa sono state coltivate sulla piattaforma fibronectina-liposoma-SLB per studiare le interazioni cellulari. La fibronectina è risultata essere fondamentale per migliorare l’adesione delle cellule HeLa sulle piattaforme. Pertanto, dopo l’adesione delle cellule, i liposomi sono stati riorganizzati spazialmente e fagocitati dalle cellule. La densità di superficie dei liposomi caricati con doxorubicina determina l’apoptosi delle cellule HeLa, confermando l’efficacia della consegna del farmaco da parte dei liposomi. Pertanto, la piattaforma modello multifunzionale potrebbe essere utile come sistema a rilascio controllato pre-somministrato per saggi basati su cellule e tessuti.
Figura 4. Fibronectina-liposoma superfici funzionalizzate basato su un bilayer lipidico biotinilato (FN-liposome-SLB). Costruzione della superficie modello comporta cinque passi: (I) formazione di SLB, (II) primo strato di legame streptavidina, (III) immobilizzazione di liposomi b-PEG, che possono contenere lipidi marcati con coloranti, o incapsulare DOX / colorante fluorescente, (IV) il secondo strato di legame streptavidina, e (V) immobilizzazione di biotinilato-fibronectina (bFN). Ristampato con il permesso di Tseng e Chang (2012). Copyright 2012 American Chemical Society.
Oltre alle proteine ECM, GAGs mostrano molteplici funzioni nei tessuti tra cui fornire supporto, mediando la differenziazione e la divisione cellulare, e prendendo parte a importanti interazioni con le proteine. Comprendere le interazioni legate ai GAG è intrinsecamente difficile e richiede piattaforme adeguate e definite. Svedhem et al. hanno mostrato due strategie di immobilizzazione per accoppiare chimicamente il solfato di condroitina GAG (CS) a SLB fluidi: 1. attivando i gruppi carbossilici su CS prima dell’aggiunta di un lipide amino-funzionalizzato, cioè, 1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamine-N-(lauroylamine) (DOPE-NH2); 2. attivando fosfolipidi carbossilici, come 1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamine-N-(lauroyl) (DOPE-COOH), seguiti dall’aggiunta di CS funzionalizzati con idrazidi (Altgarde et al., 2013). La formazione di SLBs e la successiva coniugazione è stata seguita in situ utilizzando QCM-D. I risultati mostrano che le due strategie hanno prodotto film sottili CS con proprietà viscoelastiche simili. La fluidità del bilayer lipidico non è stata influenzata dalla coniugazione di CS. Così, l’applicazione della piattaforma CS sviluppata su SLBs è stata esemplificata per il fattore di crescita che induce la proteina morfogenetica ossea-2.
Sommario e prospettive
La creazione di microambienti per la crescita e la regolazione delle cellule in vitro rimane impegnativa. La complessità delle ECM era assente nei normali sistemi di coltura cellulare, che include la fluidità, il gradiente, la proprietà meccanica, le nanostrutture e le interazioni inter- e intra-molecolari. Il sistema biomimetico SLB coniugato con componenti ECM ha fatto luce sulle effettive risposte cellulari nel microambiente in vivo. La SLB fornisce caratteristiche uniche di fluidità, resistenza al fouling, versatilità e biocompatibilità. Fino ad ora, non abbiamo trovato alcuna alternativa da utilizzare per lo stesso scopo. Le proprietà fisiche delle piattaforme SLB-ECM possono essere chiaramente definite applicando strumenti avanzati, come QCM-D, AFM e FRAP, per correlare le risposte cellulari. Inoltre, i comportamenti dinamici delle cellule sulle piattaforme SLB-ECM dovrebbero essere degni di essere seguiti perché le composizioni e le strutture ECM cambiano continuamente con la crescita delle cellule. Sulla piattaforma SLB-ECM, i ricercatori possono osservare le specifiche interazioni di riconoscimento tra le cellule e il loro microambiente per la traduzione diretta delle attività biologiche sul sistema di coltura artificiale. Oltre agli studi fondamentali, si ritiene che la piattaforma SLB-ECM sia utile per varie applicazioni, come lo screening di farmaci, la cattura di cellule rare, la medicina di rigenerazione e il biosensing.
Contributi degli autori
C-JH è responsabile della ricerca della letteratura e della scrittura. Y-CC è responsabile della scrittura e della revisione.
Finanziamento
MOST 105-2628-E-008-007-MY3; 106-2119-M-194-002; 107-0210-01-19-01; 107-2119-M-001-039 dal Ministero della Scienza e Tecnologia (MOST), Taiwan, e Academia Sinica, Taiwan.
Conflict of Interest Statement
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.
Riconoscimenti
Riconosciamo il Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST 105-2628-E-008-007-MY3; 106-2119-M-194-002; 107-2119-M-001-039) per il sostegno finanziario di questo progetto.
Altgarde, N., Becher, J., Moller, S., Weber, F. E., Schnabelrauch, M., and Svedhem, S. (2013). Immobilizzazione di condroitina solfato su membrane lipidiche e le sue interazioni con le proteine ECM. J. Colloid Interface Sci. 390, 258-266. doi: 10.1016/j.jcis.2012.07.063
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