Frontiers in Medicine

TABELLA 1

Tabella 1. I 32 volontari sono stati divisi in due gruppi: gruppo placebo (gruppo C, n = 16) e gruppo probiotico (gruppo P, n = 16). Probiotico (Bifidobacterium Tetragenous viable Bacteria Tablets (SiLianKang), Hangzhou Grand Biologic Pharmaceutical Inc. Numero di approvazione SFDA: S20060010, contenente >0,5 × 106 CFU/table Bifidobacterium infantis, >0,5 × 106 CFU/table Lactobacillus acidophilus, >0,5 × 106 CFU/table Enterococcus faecalis, e >0,5 × 105 CFU/table Bacillus cereus). Ai partecipanti è stato suggerito di mangiare porridge, noodles e altre diete a basso contenuto di fibre il giorno prima della preparazione intestinale, e di mangiare normalmente le diete dopo la colonscopia. Gli antibiotici erano proibiti durante il processo di trattamento, così come il bere e l’acrimonia. Tutti hanno iniziato a prendere preparati placebo o probiotici dopo la colonscopia per un massimo di 5-7 giorni (tre compresse e tre volte al giorno).

I partecipanti hanno preso 2 L di polietilenglicole (PEG, numero di approvazione SFDA: H20020031, contenente pacchetto A: 0,74 g di cloruro di potassio e 1,68 g di bicarbonato di sodio, pacchetto B: 1,46 g di cloruro di sodio e 5.68 g di solfato di sodio, pacchetto C: 60 g di polietilenglicole 4.000) 4-5 ore prima della colonscopia e il PEG deve essere assunto completamente entro 1 ora. Dopo l’anestesia endovenosa con 1 ml di iniezione di lidocaina cloridrato (numero di approvazione SFDA: H37021309), 1 ml di iniezione di nalbuphine cloridrato (numero di approvazione SFDA: H20130127) e 20 ml di emulsione di propofol (numero di approvazione SFDA: H20051843), i partecipanti hanno subito la colonscopia. Se i partecipanti erano intolleranti durante la colonscopia, sono stati aggiunti anestetici come appropriato. Sono state raccolte le feci in 3 pinte temporali (3 giorni prima, lo stesso giorno della preparazione intestinale appena prima della colonscopia, e 7 giorni dopo il processo). I campioni raccolti sono stati conservati in glicerolo al 50% (Cat#56-81-5; Sengon Biotech, Cina) e immediatamente conservati a -80°C per un ulteriore utilizzo.

Estrazione del DNA genomico batterico totale e sequenziamento ad alta velocità

Sono stati raccolti un totale di 96 campioni fecali, e il metodo del bead blasting combinato con il kit del DNA genomico (Tiangen Biotech Co., Ltd., Beijing, Cina) è stato utilizzato per estrarre il DNA microbico fecale (12). La concentrazione e la purezza del DNA purificato sono state determinate tramite uno spettrofotometro a 230 nm (A 230) e 260 nm (A 260) (NanoDrop; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). La regione V4 del gene 16S rDNA in ogni campione è stata amplificata con il primer 515F/806R (515F, 5′-GCACCTAAYTGGGYDTAAAGNG-3′; 806R, 5′- TACNVGGGTATCTAATCC-3′), e i prodotti della PCR sono stati sequenziati sulla piattaforma IlluminaHiSeq 2000 (numero di accesso GenBank PRJNA597277) (13).

Analisi dei dati

Per analizzare i dati di sequenziamento high-throughput, Cutadapt (versione 1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/), algoritmo UCHIME http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html, pacchetto software UPARSE (versione 7.0.100), software QIIME (versione 1.9.1), pacchetto software QIIME (versione 1.8.0) e software SIMCA-P (versione 11.5; Umetrics; Sartorius Stedim Biotech, Malmö, Svezia) sono stati utilizzati per determinare la diversità α (all’interno dei campioni, indici di OTU osservate, Chao1, Shannon, Simpson, ACE, e copertura merci) e la diversità β (tra i campioni, PCA, PCoA e NMDS) (14, 15).

I dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD). Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software Prism (versione 7.0; GraphPad Software, San Diego, CA, USA) e il software SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). La significatività statistica è stata determinata utilizzando l’analisi della varianza a senso unico (ANOVA) seguita dal test di confronto multiplo di Tukey e dai test F. Le probabilità di errore di P < 0,05 sono state considerate statisticamente significative.

Risultati

Caratteristiche di base dei pazienti

Tra dicembre 2018 e novembre 2019, 32 volontari sono stati arruolati nel gruppo placebo (gruppo C, 16 volontari) e nel gruppo probiotici (gruppo P, 16 volontari), e il loro sesso, età, BMI, caratteristiche di base, storia medica passata e reazione gastrointestinale prima e dopo la preparazione intestinale erano riassunti nella Tabella 1. Non c’era nessuna differenza significativa tra il gruppo C e il gruppo P.

Effetto della preparazione intestinale sui microbi intestinali

Per esplorare se la preparazione intestinale può avere effetto sui microorganismi intestinali, la regione ipervariabile V4 dei batteri è stata amplificata usando il metodo di sequenziamento dell’amplificazione 16S rDNA dalle feci di 16 volontari prima (gruppo CB), durante (gruppo CM) e dopo la preparazione intestinale (gruppo CA).

Nelle figure 1A-C, l’indice di Shannon, l’indice di Simpson e le specie osservate hanno indicato che il verificarsi della preparazione intestinale ha leggermente influenzato l’α-diversità della comunità microbica intestinale tra i gruppi CB e CM, CB e CA, mentre ha significativamente influenzato la diversità microbica tra i gruppi CM e CA (P < 0.05). E l’analisi delle coordinate principali (PCoA) ha mostrato che la diversità microbica nel gruppo CM e il gruppo CA erano diversi rispetto a quello nel gruppo CB (Figura 1D). Inoltre, i risultati dell’indice di Venn (Figura 1E) hanno indicato che c’erano 2.068, 3.426 e 1.695 OTU nei gruppi CB, CM e CA, e la loro percentuale di OTU comuni era 27,71% (573/2.068), 16,73% (573/3.426) e 33,81% (573/1.695), rispettivamente.

Inoltre, abbiamo ulteriormente analizzato i batteri dominanti a livello di phylum (Figure 2A-E), e trovato che Proteobatteri, Bacteroidetes, Firmicutes e Actinobacteria erano i phyla predominanti in questi 3 gruppi. I risultati hanno rivelato che la preparazione intestinale ha aumentato l’abbondanza relativa di Proteobatteri (0.266 vs. 0.410) mentre ha diminuito l’abbondanza relativa di Actinobacteria (0.044 vs. 0.029), e ha avuto un leggero effetto sull’abbondanza relativa di Firmicutes (0.462 vs. 0.408) e Bacteroidetes (0.194 vs. 0.136) rispetto al gruppo CB. Sette giorni dopo la preparazione dell’intestino, l’abbondanza relativa dei Proteobatteri è diminuita da 0,410 a 0,335. Stranamente, l’abbondanza relativa degli Actinobatteri è aumentata da 0,029 a 0,119, mentre l’abbondanza relativa dei Firmicutes (0,409 vs. 0,389) e dei Bacteroidetes (0,136 vs. 0,126) ha mostrato ancora una tendenza alla diminuzione rispetto al gruppo CM. A livello di genere (Figure 2F-J), durante la preparazione intestinale, è stato osservato che l’abbondanza relativa di Bacteroides e Acinetobacter erano batteri dominanti, l’abbondanza relativa di Acinetobacter (0,042 vs. 0,176) era significativamente aumentata, e l’abbondanza relativa di Streptococcus (0,020 vs. 0,008), Bifidobacterium (0,036 vs. 0,022) e Faecalibacterium (0,075 vs. 0,065) era leggermente alterata rispetto al gruppo CB. Sette giorni dopo la preparazione dell’intestino, tuttavia, c’era un aumento significativo della percentuale di Streptococcus (0.007 vs. 0.068) e Bifidobacterium (0.022 vs. 0.109), e una diminuzione dell’abbondanza relativa di Faecalibacterium (0,065 vs. 0,031) e Acinetobacter (0,176 vs. 0,136) rispetto al gruppo CM.

Effetto della preparazione probiotica sull’equilibrio microbico intestinale

Per valutare gli effetti dei probiotici sul microbiota intestinale dei volontari che hanno ricevuto la preparazione intestinale, le feci sono state raccolte prima (gruppo PB), durante (gruppo PM) e dopo la preparazione intestinale (gruppo PA) per 7 giorni (hanno assunto la preparazione probiotica per 5-7 giorni).

Abbiamo osservato che la preparazione intestinale aveva influenzato notevolmente la α-diversità sull’indice Shannon (Figura 3A) e l’indice Simpson (Figura 3B, P < 0.05) della comunità microbica tra i gruppi PB e PM. È interessante notare che le specie osservate hanno ricevuto un aumento evidente dopo la preparazione intestinale, ma una riduzione evidente 7 giorni dopo il trattamento (Figura 3C). Inoltre, i risultati PCoA hanno indicato che l’assunzione di probiotici ha notevolmente ripristinato il microbiota disturbato a livello normale nel gruppo PM e nel gruppo PA (Figura 3D), e le OTU comuni hanno occupato 28,68% (508/1.771), 23,67% (508/2.146) e 36,92% (508/1.376) delle OTU totali nei gruppi PB, PM e PA, rispettivamente.

Poi, abbiamo ulteriormente valutato gli effetti dell’intervento probiotico sulla composizione microbica, e trovato integrazione di probiotici significativamente ridotto Proteobatteri (0.515 vs. 0.173) e fortemente aumentato l’abbondanza relativa di Bacteroides (0.166 vs. 0.338) nel gruppo PM rispetto al gruppo PA a livello di phylum (P < 0.05). A livello di genere, i probiotici integrati avevano ovviamente ridotto la percentuale di Acinetobacter (0,204 vs. 0,071) nel gruppo PM rispetto al gruppo PA, e aumentato significativamente la percentuale di Bifidobacterium (0.017 vs. 0,110), Bacteroides (0,095 vs. 0,155) e Faecalibacterium (0,028 vs. 0,060) nel gruppo PM rispetto al gruppo PA (Figure 4F-J).

I cambiamenti microbici tra gruppi gruppo CA e gruppo PA

Per comprendere meglio l’effetto dei probiotici sulla preparazione intestinale, abbiamo confrontato la diversità microbica tra i volontari nei gruppi CA e PA. Come mostrato nelle figure 5A-C, l’integrazione di probiotici aveva notevolmente migliorato l’indice di Shannon e l’indice Simpson (P < 0,05), mentre diminuiva la specie osservata. I risultati PCoA hanno indicato che i campioni nel gruppo CA e nel gruppo PA si sono sparpagliati molto lontano l’uno dall’altro (Figura 5D). C’erano 1.695 e 1.376 OTU nel gruppo CA e nel gruppo PA, e il numero comune di OTU era 570 (Figura 5E). Inoltre, l’analisi Lefse ha dimostrato che Bacteroidia (a classe), Bacteroidetes (a phylum), Bacteroidaceae (a famiglia), Bacteroides (a genere), Fusobacteriaceae (a famiglia), Porphyromonadaceae (a famiglia), e Parabacteroides (a genere) erano significativamente più alti nel gruppo PA che nel gruppo CA (Figura 5F).

Poi, sono stati confrontati i batteri specifici nel gruppo CA e nel gruppo PA. La supplementazione di probiotici ha notevolmente arricchito la percentuale di Bacteroidetes (0.126 vs. 0.338), mentre ridotto la percentuale di Proteobacteria (0.335 vs. 0.173) e Firmicutes (0.389 vs. 0.330) rispetto al gruppo PA a livello di phylum (P < 0.05). A livello di genere (Figure 6E-K), l’integrazione di probiotici ha diminuito l’abbondanza relativa di Acinetobacter (0,136 vs. 0,071) e Streptococcus (0,068 vs. 0,023), mentre ha aumentato l’abbondanza relativa di Bacteroides (0.068 vs. 0,155), Roseburia (0,02 vs. 0,04), Faecalibacterium (0,031 vs. 0,060) e Parabacteroides (0,16 vs. 1,92%).

Discussione

La pulizia dell’intestino è necessaria durante la colonscopia, e il suo uso prolungato di sicurezza fa ignorare l’impatto negativo sui microrganismi intestinali (16). Come sappiamo, i microrganismi del colon sono la base per promuovere le normali funzioni fisiologiche dei mammiferi, tra cui l’angiogenesi, il metabolismo, la digestione e lo sviluppo del sistema immunitario (17). Inoltre, varie malattie, tra cui l’obesità, il diabete di tipo 2, il cancro colorettale e le malattie infiammatorie intestinali si verificano quando il microbiota intestinale non è in equilibrio (8, 9, 18).

I componenti principali del normale microecosistema intestinale sono anaerobi obbligati (Bacteroidetes e Firmicutes), e gli anaerobi facoltativi (come i Proteobatteri) di solito rappresentano solo una piccola parte, e lo squilibrio del microbiota intestinale è spesso causato dal numero crescente di anaerobi facoltativi (19). La preparazione intestinale può portare una grande quantità di ossigeno nella cavità intestinale, danneggiare l’ambiente anaerobico della cavità intestinale e fornire un buon ambiente di crescita per i batteri anaerobi facoltativi o aerobi. Gli studi precedenti e il presente lavoro, allo stesso modo, hanno dimostrato che la preparazione intestinale aveva notevolmente aumentato l’abbondanza di Proteobatteri .

In questo studio, abbiamo trovato che la preparazione intestinale significativamente diminuito phyla Bacteroidetes e Firmicutes (Figura 2), e prendendo probiotici aveva poco effetto sul phylum Firmicutes, mentre notevolmente aumentato l’abbondanza di Bacteroidetes (Figura 4). Studi precedenti avevano dimostrato che l’aumento dell’abbondanza di Firmicutes e la diminuzione dell’abbondanza di Bacteroidetes erano strettamente legati a condizioni malsane. Pertanto, l’aumento di Firmicutes/Bacteroidetes può rappresentare un potenziale rischio per la salute del paziente (20-22). Nel presente studio, abbiamo scoperto che il rapporto Firmicutes/Bacteroidetes nel gruppo CA (3,08) era superiore a quello del gruppo PA (0,98), suggerendo che l’assunzione di probiotici potrebbe ridurre i potenziali rischi di malattia attraverso la preparazione intestinale. Inoltre, il corpo umano di solito non ha la capacità di degradare la maggior parte dei polisaccaridi complessi (il componente principale e la principale fonte di nutrimento della nostra dieta quotidiana) fino a raggiungere il colon, e i batterioideti svolgono un ruolo vitale nel degradare i polisaccaridi complessi di cellulosa, pectina e xilano, che possono aiutare le persone ad assorbire più energia dalla dieta (23). Inoltre, il butirrato prodotto dai Bacteroidetes svolge un ruolo importante nel mantenimento della salute intestinale dell’ospite, esercitando l’immunità e l’effetto antitumorale (24).

A livello di genere, l’integrazione di probiotici ha ridotto significativamente l’abbondanza di Acinetobacter che è un batterio aerobico e gram-negativo comune in natura, appartenente a un patogeno vitale che causa infezioni ospedaliere soprattutto nei pazienti con bassa funzione immunitaria (Acinetobacter baumannii) (25). L’Acinetobacter era stato elencato come il terzo patogeno umano più comune nell’unità di terapia intensiva degli ospedali sudcoreani, e la sua intrinseca resistenza a una varietà di antibiotici lo ha fatto ottenere determinanti di resistenza a vari farmaci antibatterici (26). Inoltre, la preparazione intestinale ha ridotto significativamente il livello di Bacteroides, e i probiotici hanno ovviamente recuperato la sua abbondanza. Gli studi hanno rivelato che i Bacteroides possono ridurre il livello di ossigeno intestinale per promuovere la crescita di anaerobi rigorosi (23) e alcuni ceppi di Bifidobacterium sono stati messi in uso come probiotici nel cibo e nella medicina (10, 27). Bacteroides e Bifidobacterium possono stabilire un contatto stabile e a lungo termine con l’ospite e beneficiare la salute del corpo umano, possono degradare la fibra alimentare in acidi grassi a catena corta (SCFA), che fornisce fonte di energia per le cellule, promuove la funzione di barriera e riduce il verificarsi di reazioni infiammatorie (28, 29).

Alla fine, abbiamo confrontato la diversità microbica di CA e PA, e trovato che l’assunzione di probiotici prevalentemente migliorato l’abbondanza di batteri benefici come Roseburia (principalmente o solo produce butirrato, che può ridurre il livello di infiammazione nel complesso, soprattutto nel sangue, ridurre ulteriormente il grado di aterosclerosi. Rimane livelli più bassi nelle persone con malattie cardiovascolari) (30, 31), Faecalibacterium (un batterio simbiotico che esiste ampiamente nel tratto gastrointestinale di animali ed esseri umani. Era significativamente ridotto nei pazienti di Crohn, e potrebbe essere usato come probiotico per trattare la malattia di Crohn) (32-34) e Parabacteroides (può resistere all’infiammazione intestinale, i principali prodotti finali metabolici sono l’acido acetico benefico e l’acido succinico, che sono inferiori al range normale nel tratto intestinale dei pazienti con colite) (35-37) a livello di genere. Tuttavia, l’abbondanza di batteri nocivi come lo Streptococco era notevolmente ridotta (Figure 5, 6). Lo streptococco è un comune patogeno opportunista, tra cui Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans e Streptococcus pneumoniae, che può causare infiammazioni purulente, endocardite e setticemia, minacciando ulteriormente la salute umana e la vita (38, 39). Haenni et al. hanno indicato che a causa dell’uso diffuso di antibiotici tetraciclini, macrolidi e lincosamidi nel settore animale globale, la resistenza agli antibiotici di Streptococcus zooepidermidis è emersa, portando al fallimento del trattamento (40, 41).

Nel presente studio, abbiamo trovato che i probiotici orali hanno alleviato il disturbo microbico intestinale causato dalla preparazione intestinale, hanno ridotto notevolmente gli agenti patogeni di Proteobatteri (a livello di phylum), Acinetobacter (a livello di genere), Streptococcus (a livello di genere), e migliorato i probiotici di Bacteroidetes (a livello di phylum), Bacteroides (a livello di genere), Roseburia (a livello di genere), Faecalibacterium (a livello di genere) e Parabacteroides (a livello di genere). Pertanto, abbiamo motivo di credere che l’integrazione di preparati probiotici accelererà l’instaurazione dell’equilibrio microbico intestinale dopo la pulizia intestinale, sopprimerà la crescita di batteri nocivi e favorirà il mantenimento della salute intestinale.

Data Availability Statement

I set di dati generati per questo studio possono essere trovati nel NCBI: GenBank accession number PRJNA597277.

Ethics Statement

Gli studi che coinvolgono partecipanti umani sono stati rivisti e approvati dall’Institutional Review Boards del Second Affiliated Hospital of Nanchang University (Nanchang, Cina). Il progetto è stato anche registrato e approvato dal China Clinical Trial Registration Center (ChiCTR1900022539). I pazienti/partecipanti hanno fornito il loro consenso informato scritto per partecipare a questo studio.

Contributi degli autori

TC e XD hanno progettato gli esperimenti, analizzato i dati e scritto il manoscritto. CZ, HT, RY, ZL, YH e KW hanno eseguito gli esperimenti. Tutti gli autori hanno discusso i risultati e hanno commentato il manoscritto finale.

Finanziamento

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (sovvenzione n. 81960103 a XD), la Natural Science Foundation della provincia di Jiangxi (sovvenzione n. 20192ACBL20034 a ZL), il progetto scientifico e tecnologico di Jiangxi (sovvenzioni nn. 20181BBG70028, 20181BCB24003, e 20194BCJ22032 a TC), e il doppio piano 10mila della provincia di Jiangxi a TC (innovazione e professionisti della tecnologia come il talento di fascia alta).

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.