Both denatured and native BR can bind to GroEL
Centrale nel meccanismo dell’attività di GroEL è la sua capacità di riconoscere una gamma diversa di polipeptidi principalmente attraverso interazioni tra i residui idrofobici del substrato e le eliche H e I sui domini apicali di GroEL (Fig. 1A) (Coyle et al. 1997). Qui, il legame di BR denaturato e nativo a GroEL è stato prima esaminato dalla calorimetria di titolazione isotermica (ITC), poiché ogni stato ha abbondanti residui idrofobici di superficie che sono facilmente accessibili a GroEL. Come mostrato in Fig. 2A, la titolazione di GroEL con BR produce termogrammi di titolazione esotermici in entrambi i casi. I cambiamenti di calore sono dovuti specificamente al legame di BR a GroEL come iniezione consecutiva di BR nei buffer di dosaggio senza la chaperonina produce termogrammi piatto (Fig. S1 supplementare). Calore di ogni iniezione mostrato in Fig. 2A è stato integrato, corretto dal calore di diluizione, ed è stato tracciato contro il rapporto molare di BR: GroEL (Fig. 2B). La variazione di calore si adatta a una serie di siti modello di legame (curve rosse e blu), producendo una costante di dissociazione (Kd) vicino a 0,3 nmol / L per BR denaturato e vicino 6,0 nmol / L per BR nativo, rispettivamente (Tabella 1). Così la denaturazione di BR ha aumentato l’affinità di legame di GroEL per questa proteina di membrana di un ordine di grandezza. D’altra parte, il legame di entrambi i campioni di BR è guidato da un cambiamento di entalpia favorevole (ΔH) e contrastato da un cambiamento di entropia negativa (ΔS); la stechiometria di legame (N) determinata in entrambi i casi è vicina all’unità (Tabella 1). Tuttavia, il legame del BR nativo è chiaramente meno entalpico con una minore compensazione dell’entropia.
Il legame del BR a GroEL valutato da ITC. A Titolazione di GroEL con SDS-denaturato BR (dBR, rosso) o BR nativo (nBR. blu). I termogrammi sono stati registrati a 20 °C con uno strumento MicroCal ITC200. B scambio di calore di ogni iniezione in A è stato integrato e tracciato vs il BR: GroEL rapporto molare. Le linee solide rappresentano l’adattamento dei dati ad un modello a singolo set di siti (tutti i siti identici ed equivalenti) e i parametri termodinamici ottenuti sono elencati nella Tabella 1
La cochaperonina GroES a forma di coperchio è un componente essenziale nel ripiegamento delle proteine mediato da GroEL nei batteri, ed è stato dimostrato che condivide gli stessi siti di legame su GroEL con il substrato (Chen e Sigler 1999). La titolazione di GroEL con BR denaturato in presenza di GroES indica che GroES ha poco effetto sul legame di BR (Fig. S2 supplementare e Tabella 1). Questo risultato può essere compreso prendendo in considerazione Kd, che per la formazione di un complesso GroEL/ES è stato precedentemente determinato in 3 μmol/L ed è significativamente più alto di quello del complesso BR-GroEL determinato qui (Behlke et al. 1997). Questo indica un’interazione molto più debole delle due proteine chaperonin e quindi coerente con l’effetto insignificante. Tuttavia, in presenza di ATP, che regola i cicli di legame e rilascio di GroEL e GroES in vivo, l’affinità di GroEL/ES aumenterebbe di tre ordini di grandezza (normalmente Kd ~1 nmol/L) (Farr et al. 2000), teoricamente capace di competere con il legame di BR a GroEL. L’effetto di apoGroEL sul ripiegamento di BR e quindi il ruolo di GroES e ATP in questo processo sono stati successivamente studiati.
Il sistema GroEL-GroES può modulare il ripiegamento di BR in presenza di DDM
Si è osservato che una parte di BR denaturata in SDS si ripiega quando viene diluita con un eccesso di detergente solubilizzante n-dodecil-β-D-maltoside (DDM), come rivelato dalla misurazione del recupero dell’assorbimento retinico (fig. S3 supplementare) (Booth 1997). Nessun recupero significativo è stato rilevabile nel tampone di test senza detergente o integrato con GroEL da solo. Tuttavia, in presenza di DDM, l’aggiunta di GroEL ha mostrato un effetto evidente sul ripiegamento di BR (Fig. S3 supplementare). Costante di velocità per il GroEL (0,15 μmol / L) – ripiegamento mediato, come valutato dal montaggio con cinetica esponenziale singolo, è stato stimato essere ~ due volte inferiore al ripiegamento spontaneo. GroEL è noto per ritardare tipicamente il ripiegamento delle proteine solubili che possono piegare in modo efficiente in sua assenza. Questo è stato spiegato attraverso una competizione tra il ripiegamento intramolecolare e il legame intermolecolare a GroEL (Gray e Fersht 1993; Itzhaki et al. 1995). Sembra del tutto plausibile che GroEL si comporti in modo simile nel refolding di BR denaturato. Quando la concentrazione di GroEL è stata aumentata a 0,30 μmol/L, la costante di tasso stimata non è cambiata ovviamente, mentre la resa di ripiegamento ha raggiunto un livello molto più alto del ripiegamento spontaneo dopo 60 min (Fig. S3 supplementare). Questi dati dimostrano che apoGroEL può diminuire il tasso di ripiegamento BR ma migliorare la resa della proteina ripiegata.
Perché le cellule batteriche contengono diversi millimetri di ATP e in condizioni normali, il rapporto molare relativo di GroES contro GroEL è 1,9 e dopo lo shock termico 4,7 (Moparthi et al. 2013); GroEL difficilmente rimarrà a lungo senza legare ATP e GroES. In presenza di ATP (blu in Fig. 3A), il recupero di BR correttamente piegato era significativamente più veloce e maggiore rispetto a quello con apoGroEL da solo o il processo spontaneo (rosso e nero in Fig. 3A). Al contrario, la combinazione di GroEL e GroES ha mostrato poco effetto sul tasso di ripiegamento spontaneo ma ha ridotto la resa in una certa misura (Fig. 3A, ciano). Questo indica un’interazione tra GroEL e GroES senza necessità di ATP, probabilmente indotta da BR legata a GroEL, che a sua volta ha avuto un effetto negativo sul recupero della proteina correttamente ripiegata. Quando è stato usato il sistema completo di chaperonina (Fig. 3A, verde), è stato osservato il massimo aumento del tasso, ma la resa di ripiegamento è caduta tra i due casi precedenti.
Corso temporale del ripiegamento di BR modulato dal sistema GroEL-GroES dipendente dall’ATP. A Il recupero di BR piegato è stato continuamente monitorato con assorbanza a 554 nm. Le seguenti aggiunte sono state fatte: nessuno (nero); 0.3 μmol/L GroEL (rosso); 0.3 μmol/L GroEL e 5 mmol/L ATP (blu); 0.3 μmol/L GroEL e 0.6 μmol/L GroES (ciano); 0.3 μmol/L GroEL, 0.6 μmol/L GroES e 5 mmol/L ATP (verde). B netto GroEL-mediata BR piegatura è stata effettuata prima, poi a T = 60 min il campione è stato integrato con solo ATP, con solo GroES, o con entrambi come indicato. C Per il confronto con A, l’effetto di non-riciclo singolo anello (SR1) versione di GroEL sul ripiegamento BR è stato analizzato anche. Le concentrazioni di SR1, GroES, e ATP utilizzati erano 0,6 μmol / L, 1,2 μmol / L, e 5 mmol / L, rispettivamente. D Gli effetti di GroEL/ES più ATP sul fold nativo di BR sono stati esaminati seguendo il cambiamento di assorbanza a 560 nm. Le concentrazioni di chaperonin e nucleotide utilizzati in B e D erano gli stessi di A. BR è stato tenuto a 2,4 μmol / L in tutti gli esperimenti. Le linee blu e verde in A e la linea blu in C rappresentano l’adattamento dei dati a tre fasi equazione esponenziale, mentre le linee rimanenti sono l’adattamento con equazione esponenziale singolo. Tutte le linee in B e D sono semplici guide per gli occhi
I risultati di cui sopra indicano che ATP e GroES possono influenzare il ripiegamento di BR mediato da GroEL in modo diverso. Il legame di GroES a GroEL è in qualche modo dannoso per il ripiegamento, in contrasto con il ben noto ruolo positivo dell’incapsulamento del substrato nella gabbia GroEL/ES per il ripiegamento assistito (Jewett e Shea 2010). Ci siamo poi chiesti come sia stato prodotto questo effetto negativo. Intrigante, GroES da solo o la sua sequenza di loop mobile attraverso la quale GroES si lega a GroEL ha anche facilitato il recupero di BR piegato (Fig. S4 supplementare). Inoltre, la sequenza di loop ha mostrato un effetto simile a GroES nel ripiegamento mediato da GroEL in assenza e presenza di ATP (Fig. S4 supplementare). Anche se non può formare un tappo sigillato sopra la cavità centrale GroEL come GroES, che implica un contributo significativo dall’interazione loop-GroEL al ripiegamento. In particolare, i residui idrofobici sulla superficie apicale di GroEL coinvolti nel legame GroES mobile loop per lo più si sovrappongono a quelli coinvolti nel legame della proteina substrato (Motojima et al. 2000). È improbabile che il BR idrofobico sia stato spostato e liberato nella gabbia idrofila GroEL/ES dal ciclo mobile, specialmente data la presenza di micelle DDM al di fuori della gabbia, che favorirebbero ulteriormente il ripiegamento o la solubilizzazione del BR. Preferibilmente, come dimostrato per il ripiegamento assistito di diverse proteine solubili (Motojima e Yoshida 2010), BR può essere catturato vicino all’interfaccia GroEL/ES, sporgendo parzialmente all’esterno quando l’intero sistema o anche GroEL/ES da solo è stato usato in questo studio. Tale interazione potrebbe impedire a BR di accedere alle micelle DDM favorevoli, determinando così la ridotta resa di ripiegamento osservata sia con GroES che con il suo anello mobile.
Tuttavia, alcuni studi suggeriscono che il ruolo di ATP e GroES sia solo quello di dissociare substrati appiccicosi (cioè con una Kd nella regione nmol/L determinata qui), che limitano il tasso di ripiegamento assistito o addirittura inibiscono l’attività di ripiegamento di GroEL se non rimossi (Priya et al. 2013). Per verificare se GroES e ATP mostrano un effetto simile nel ripiegamento assistito di BR, abbiamo prima incubato apoGroEL con BR denaturato per 60 min; poi, abbiamo aggiunto GroEL o/e ATP (Fig. 3B). L’aggiunta successiva di uno dei due componenti ulteriormente promosso BR piegatura, ma era meno efficace l’aggiunta simultanea di entrambi, dimostrando sinergia tra i due ad aiutare il GroEL-mediata piegatura. Misure di anisotropia con peptidi transmembrana BR, che sono stati utilizzati come mimetici per BR denaturato per aggirare le complicazioni introdotte dalla natura dinamica di BR denaturato e di GroEL-BR interazioni, ha mostrato che solo la combinazione di ATP e GroES era in grado di separare in modo efficiente il complesso preformato peptide-GroEL (supplemento Fig. S5). Quindi, sembra che sia GroES che ATP siano necessari per dissociare i conformatori BR ad alta affinità e rigenerare i siti di legame GroEL (o catalitici) in stallo.
Per esaminare ulteriormente l’effetto di GroES e ATP sul ripiegamento BR mediato da GroEL, abbiamo usato un mutante GroEL ad anello singolo (SR1) che forma un complesso stabile con GroES (Weissman et al. 1995), in contrasto con il sistema GroEL-GroES in bicicletta. Simile alla nostra osservazione con GroEL, ATP ha aumentato il tasso e la resa di SR1-mediata piegatura (blu in Fig. 3C), mentre la presenza di GroES ridotto entrambi gli aspetti notevolmente (ciano) rispetto al caso con apoSR1 solo o il processo spontaneo (rosso o nero). Come BR denaturato è stato determinato da ITC per legarsi a SR1 con una stechiometria vicino all’unità (supplemento Fig. S2), e SR1 utilizzato era il doppio della concentrazione di GroEL, si ipotizza che più BR-SR1 complessi formati che BR-GroEL, per cui GroES esercitato più influenza sul ripiegamento (ciano). Come previsto, l’aggiunta sia di ATP che di GroES ha mostrato un effetto insignificante sul recupero di BR (verde), attribuibile al legame irreversibile di GroES a SR1 in presenza di ATP (Weissman et al. 1995). Inoltre, questo risultato indica che l’aumento del tasso massimo osservato con GroEL è dovuto a cicli multipli regolati da ATP di legame e rilascio di GroES.
GroEL da solo o in combinazione con ATP o/e GroES ha mostrato un’influenza trascurabile sulla struttura della BR nativa solubilizzata con DDM (Fig. 3D), indicando una più forte interazione intramolecolare all’interno della proteina nativa che il legame intermolecolare a GroEL. Così la transizione chaperonin-mediata di BR dallo stato metastabile denaturato allo stato nativo è termodinamicamente favorevole.
Evidenza sia per la chaperonin-mediata disaggregazione e unfolding
Misurare il ripiegamento spontaneo BR a concentrazioni diverse dimostra che l’aggregazione ha portato solo parziale recupero di BR correttamente piegato e il tasso apparente era indipendente dalla concentrazione, il che implica che l’aggregazione era irreversibile (fig. supplementare S6). In assenza di solubilizzare DDM detergente, SDS-denaturato BR è stato stimato dalla spettroscopia di correlazione di fluorescenza (FCS) per avere un coefficiente di diffusione (~ 67 μm2 / s) molto inferiore a quello legato a GroEL (~ 104 μm2 / s) (Fig. 4). Questo riflette che gli aggregati formati dal BR denaturato sono ancora più grandi del complesso BR-GroEL con una stechiometria di legame vicino all’unità come determinato da ITC. Questo significa anche che GroEL è stato in grado di interrompere la struttura di aggregazione, essenzialmente pompando il percorso di ripiegamento produttivo con BR monomerico. Inoltre, la nBR solubilizzata con DDM è stata determinata per avere un coefficiente di diffusione di ~117 μm2/s, che è maggiore di quello di dBR con GroEL e molto maggiore di quello di dBR da solo (Fig. 4). Questo suggerisce che nBR era ben disperso in presenza di DDM e supporta anche l’idea di GroEL-mediata disaggregazione di dBR. Inoltre, quando il sistema completo di chaperonina è stato aggiunto in BR denaturato, precipitati bianchi flocculanti erano immediatamente visibili (dati non mostrati), indicando unfolding forzato così come la sinergia tra GroES e ATP in questo aspetto. Senza detergenti solubilizzanti o lipidi che imitano le membrane biologiche nella soluzione di massa, la BR non piegata si aggregherà istantaneamente e precipiterà, in contrasto con il significativo aumento del tasso di piegatura osservato in presenza di DDM.
MisuraFCS della BR denaturata in assenza o presenza di GroEL rispetto alla BR nativa. Le ampiezze di autocorrelazione G(τ) della fluorescenza Alexa Fluor 488 sono state mostrate per BR denaturato in SDS da solo o con un eccesso di GroEL in assenza di detergente solubilizzante o BR nativo solubilizzato con DDM. I coefficienti di diffusione (D) sono stati ottenuti adattando la curva di autocorrelazione con l’Eq. 1. Le deviazioni standard sono state ottenute da tre misurazioni indipendenti
Inserimento di membrana di BR mediato da GroEL-GroES
Per determinare se o come GroEL-GroES possa sostenere l’integrazione di BR nel bilayer, sono state preparate vescicole di membrana citoplasmatica invertite (IMV) da cellule di Escherichia. coli e mescolati con BR denaturato in presenza e assenza di apoGroEL, o più ATP/GroES (Fig. 5A). ApoGroEL ha causato un cambiamento insignificante nel recupero di BR correttamente piegato in IMVs, come misurato dalla spettroscopia UV-Vis (nero e rosso). Diverso dal refolding in micelle DDM, aggiunta di GroEL e ATP è stato dimostrato di essere dannoso per l’inserimento della membrana (blu), mentre GroEL combinato con GroES facilitato questo processo (ciano). La vera ragione di questa differenza riproducibile non è nota, ma la rigidità di IMVs e il cambiamento strutturale di GroEL-bound BR indotta da ATP o GroES legame potrebbe essere possibili ragioni. In particolare, il legame di ATP da parte di GroEL è noto per causare un’espansione dell’apertura della cavità della chaperonina (Skjaerven et al. 2015). Questo cambiamento è più apprezzabile di quello causato dal semplice legame di GroES a GroEL (Kim et al. 2005), permettendo così eventualmente lo svolgimento del substrato legato (Lin et al. 2008; Sharma et al. 2008), favorevole al ripiegamento produttivo in un solvente adeguato. Tuttavia, a differenza delle micelle DDM che è altamente dinamico, IMVs era probabilmente in grado di proteggere prontamente le specie BR unfolded e fornire tempestivamente un microambiente pieghevole vantaggioso. In confronto, la debole associazione di GroES con GroEL in assenza di ATP potrebbe consegnare BR al IMVs preparato in modo più efficiente. Tuttavia, in modo simile al refolding nelle micelle DDM, il sistema completo GroEL-GroES ha notevolmente migliorato l’inserimento di BR nella membrana (verde), che ha raggiunto rapidamente uno stato stazionario con la quantità di BR recuperata che si colloca tra i due casi precedenti.
Inserimento di BR in IMVs mediato dal sistema GroEL-GroES. A Inserimento e / o refolding di BR denaturato (2,4 μmol / L) in IMVs sono stati continuamente monitorati con assorbanza a 554 nm. Le seguenti aggiunte sono state fatte: nessuno (nero); 0.3 μmol/L GroEL (rosso); 0.3 μmol/L GroEL e 5 mmol/L ATP (blu); 0.3 μmol/L GroEL e 0.6 μmol/L GroES (ciano); 0.3 μmol/L GroEL, 0.6 μmol/L GroES e 5 mmol/L ATP (verde). B BR nativo può essere efficacemente trasferito a IMVs in presenza di GroEL con l’aiuto di ATP e GroES. Le concentrazioni testate di BR nativo, GroEL, GroES, e ATP erano 0,4, 5, 10 μmol/L, e 5 mmol/L, rispettivamente
In seguito, l’anisotropia di fluorescenza è stata impiegata per sondare gli effetti delle chaperonine batteriche sull’inserimento di BR in IMVs (Fig. 5B). Quando BR nativo marcato fluorescentemente è stato mescolato con una quantità eccessiva di GroEL, l’anisotropia si è spostata verso un valore più alto, dimostrando che la proteina di membrana ha formato un complesso stabile con la chaperonina. È importante notare che la successiva aggiunta di IMV ha portato a un ulteriore aumento dell’anisotropia, indicativo dell’integrazione di BR in IMV. ATP e GroES sono stati trovati per migliorare ulteriormente il trasferimento di BR nella membrana, come giudicato anche dall’aumento dell’anisotropia. Questi risultati sollevano la prospettiva che GroEL, insieme a GroES e ATP, possa avere un ruolo diretto nell’integrazione delle proteine nel bilayer lipidico in vivo.