Isolamento batterico

Introduzione

Ci sono circa 10.000 specie nominate di microbi. Si stima che ci siano tra 10.000 e 100.000 specie non identificate per ogni specie identificata. Non solo ci sono molti tipi di batteri, ci sono molti batteri individuali. Un solo cucchiaio di terra può avere 100 milioni di singoli batteri. Una raschiatura delle gengive può produrre 1 milione di batteri per cm2 (un cm2 è circa la dimensione di un’unghia). I batteri nel e sul nostro corpo costituiscono circa il 10% del nostro peso corporeo secco.

La maggior parte delle specie di batteri attualmente conosciute sono state identificate usando tecniche microbiologiche tradizionali come la reazione di colorazione di Gram, la morfologia e le reazioni metaboliche. I batteri raramente vivono da soli ma in comunità con altri batteri. Questo è vero sia nell’ambiente che nel e sul nostro corpo. Questa classe si concentra sul ruolo dei batteri nelle malattie. Isolare una singola specie di batterio è il primo passo per identificare i batteri possibilmente responsabili di un processo di malattia.

Il primo requisito per isolare fisicamente un batterio è che possa essere coltivato in laboratorio. Questo richiede la conoscenza della temperatura ottimale per la crescita, i requisiti ottimali di ossigeno e le esigenze nutrizionali ottimali. In questo corso lavoriamo con un numero molto limitato di batteri. I batteri con cui lavoriamo sono anche molto facili da coltivare in laboratorio. La maggior parte dei batteri non sono così piacevoli!

Ci sono due modi principali per isolare gli organismi.

1. Streaking per l’isolamento su una piastra di agar
2. Il metodo della piastra di colata

Streaking per l’isolamento su una piastra di agar comporta la successiva diluizione degli organismi fino ad avere le cellule ad una densità abbastanza bassa che le singole cellule sono fisicamente isolate spazialmente per dare origine a colonie individuali riconoscibili. Nel metodo della piastra di coltura, si diluisce sufficientemente il campione prima di aggiungerlo all’agar raffreddato fuso e poi si versa questa miscela in un piatto. Le cellule isolate danno origine a colonie individuali che crescono nell’agar stesso. Questa tecnica può essere un po’ complicata. Se l’agar fuso è troppo caldo si uccidono tutti i batteri. Se l’agar fuso è troppo freddo vi ritroverete con un grosso grumo nella vostra capsula di Petri. Il metodo dello streaking produce colonie individuali sulla superficie dell’agar. Questa tecnica è molto più veloce e facile da padroneggiare.

Panoramica

Ti verrà dato un campione di brodo contenente tre organismi, Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens, ed Escherichia. coli.

Tutti e tre gli organismi crescono facilmente in modo aerobico su tryptic soy agar (TSA). Tuttavia, S. marsescens forma un pigmento rosso solo a 35°C o meno e in modo ottimale a temperatura ambiente (25°C). Cresce molto rapidamente a tutte le temperature in colonie di medie dimensioni.

E. coli ha un aspetto abbronzato a tutte le temperature ed è anche un rapido coltivatore che forma grandi colonie.

S. xylosus ha un aspetto giallo-arancione a tutte le temperature, cresce rapidamente e forma colonie medie e grandi.

La tua capacità di isolare e vedere i tre organismi sulla tua piastra dipende dalle condizioni di incubazione appropriate. Le tue piastre saranno incubate a temperatura ambiente per 48 ore. Dovresti essere in grado di identificare i tre organismi sulla base della dimensione delle colonie e del pigmento.

Materiali

• 1 coltura mista in provetta di brodo di soia tripticata (TSB) contenente Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens, ed Escherichia. Coli (tutti BSL2)
• 3 piastre TSA

Streaking per la procedura di isolamento

Ci sono diversi metodi di streaking per l’isolamento. La stragrande maggioranza dei nostri studenti ha avuto più successo con il metodo di streaking a quadranti che è descritto di seguito.

1. Etichetta la tua piastra con il tuo nome, la data, la sezione e l’organismo.
2. Usa le procedure BSL2 per ottenere un loop pieno di organismi dalla tua provetta di brodo di soia tryptic (TSB). Fai riferimento al protocollo di tecnica asettica.
   • Assicurati di aver mescolato adeguatamente la tua provetta di brodo in modo che gli organismi siano uniformemente sospesi nel brodo.
3. Recupera la tua provetta TSB.
4. Puoi fare la prossima parte con la tua piastra sul banco del laboratorio o tenendola in mano. Decidete voi quale funziona meglio. Trascina leggermente il tuo anello avanti e indietro sulla superficie dell’agar. (Riferirsi alla figura 1.)
   • Più si trascina più batteri si depositano.
   • L’idea generale è quella di diminuire la concentrazione batterica con ogni strisciata.
   • Da quattro a cinque zigzag sembra funzionare bene.
   • Sperimenta con le tue diverse piastre. Assicurati di tenere traccia di ciò che hai fatto su ogni piastra.
5. Se stai usando un inceneritore, sterilizza il tuo loop. Se stai usando dei loop di plastica, getta il tuo loop usato nel contenitore del cavicida e procurati un nuovo loop di plastica sterile.
6. Non tornare nella provetta di brodo originale.
7. Tocca il tuo loop sulla superficie dell’agar contro l’estremità della tua prima striscia. Ripeti trascinando avanti e indietro.
   • o Non trascinare nel centro della tua piastra.
   • o Dovresti essere in grado di vedere le deboli rientranze della tua linea di striatura sulla superficie dell’agar.
8. Utilizzando un anello sterile, ripeti la procedura sulla tua seconda striscia.
9. Utilizzando un anello sterile, ripeti la procedura sulla tua terza striscia. Zigzagare l’ultima parte nel centro della piastra.
   • Dovresti finire con delle colonie isolate da qualche parte nella tua ultima striscia.
10. Se stai usando un inceneritore, sterilizza il tuo loop. Se stai usando dei loop di plastica, getta il tuo loop usato nel contenitore del cavicida.
11. Riposiziona il coperchio sulla tua piastra.
12. Posiziona le tue piastre completate lato agar in alto sul rack di incubazione sul banco anteriore nella sezione di incubazione.

Figura 1: Metodo a quadranti di streaking per l’isolamento.

Note

• E’ assolutamente essenziale che sterilizziate il vostro loop tra ogni streaking, usando l’inceneritore o ottenendo un nuovo loop di plastica sterile. Questo è l’errore più comune che gli studenti fanno.
• Non lasciate la vostra piastra aperta troppo a lungo o batteri extra dall’ambiente cadranno nella vostra piastra.
• Non siate delusi se non ottenete colonie isolate al vostro primo tentativo. Questa è una procedura difficile.