Identificazione, caratterizzazione e verifica delle proteine 130 e 131 come 14-3-3
Figura 1.
Figura 1. Regioni di gel macchiati d’argento che mostrano i punti proteici 130 e 131 dopo l’elettroforesi bidimensionale.
Pannello A mostra fluido cerebrospinale normale, con macchie 130 e 131 assenti. Il pannello B mostra il liquido cerebrospinale di un paziente con la malattia di Creutzfeldt-Jakob; le frecce indicano i punti 130 e 131. I gel nei pannelli C e D provengono da un estratto di cervello umano normale. Pannelli A, B, e C mostrano la stessa regione gel, con punti isoelettrici che vanno da 4,8 a 6,0 (da sinistra a destra) sull’asse x, e dimensioni che vanno da 10 a 40 kd (dal basso verso l’alto) sull’asse y. La casella tratteggiata nel pannello C delinea la regione mostrata nel pannello D da un gel con un intervallo di pH di 4,5 a 5,4. Le frecce nei pannelli B e C indicano la posizione dei punti 130 e 131, che sono etichettati nel pannello D.
I risultati dell’elettroforesi bidimensionale per il rilevamento delle proteine 130 e 131 del liquido cerebrospinale in pazienti con malattia di Creutzfeldt-Jakob sono mostrati nella Figura 1A e Figura 1B. Recenti miglioramenti tecnici hanno portato ad una maggiore risoluzione, con sei macchie piuttosto che le due (corrispondenti alle proteine 130 e 131) originariamente descritte. Al fine di trovare una fonte abbondante di queste proteine, abbiamo esaminato il tessuto cerebrale normale per determinare se qualsiasi proteine del cervello si trova vicino alla costellazione di macchie corrispondenti alle proteine 130 e 131 del liquido cerebrospinale. La figura 1C mostra una regione di un gel colorato con argento dopo l’elettroforesi bidimensionale di proteine cerebrali normali. Diverse proteine appaiono nella stessa area della costellazione 130-131, comprese due che hanno la stessa carica e massa della costellazione 130-131 nel liquido cerebrospinale. L’identificazione dei due spot sulla base della loro posizione è stata confermata da studi di comigrazione. Lo spot 130 è stato purificato mediante elettroforesi bidimensionale a banda stretta (range di pH da 4,5 a 5,4), come mostrato nella Figura 1D.
Lo spot 130 è stato estratto da 10 blot, digerito enzimaticamente e microsequenziato. Le sequenze di amminoacidi sono state ottenute da quattro frammenti di peptide. Tre di queste sequenze, Val-Thr-Glu-Leu-Asn-Glu-Pro-Leu-Xaa-Asn-Glu-Asp-Xaa-Asn-Leu-Leu-Ser-Val-Ala, Asp-Tyr-Tyr-Xaa-Tyr-Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Gly-Glu-Lys, e Asn-Val-Val-Xaa-Ala-Arg-Arg-Ser-Ser-Xaa-Arg-Val-Ile-Ser-Ser-Ile-Gln, corrispondevano alla sequenza della proteina umana 14-3-3, isoforma eta. La quarta sequenza, Tyr-Ser-Glu-Ala-Xaa-Glu-Ile-Ser, corrispondeva alla proteina 14-3-3 bovina, isoforma gamma.
L’anticorpo 14-3-3 ha reagito specificamente con le proteine 130 e 131 del liquido cerebrospinale su un immunoblot elettroforetico bidimensionale ma non ha reagito con altre proteine del liquido cerebrospinale, verificando così che le proteine 130 e 131 del liquido cerebrospinale sono proteine 14-3-3.
14-3-3 Immunoassay
Figura 2.
Figura 2. Immunostaining per l’anticorpo policlonale di coniglio Anti-14-3-3β dopo l’elettroforesi di sodio dodecil solfato-poliacrilamide-Gel.
La corsia 1 mostra il liquido cerebrospinale di un paziente con evidenza patologica della malattia di Alzheimer, le corsie 2 e 3 mostrano il liquido cerebrospinale di due pazienti con la malattia di Creutzfeldt-Jakob, la corsia 4 mostra il liquido cerebrospinale di una mucca normale, la corsia 5 mostra il liquido cerebrospinale di una mucca con encefalopatia trasmissibile di visone indotta sperimentalmente ed evidenza patologica di malattia spongiforme, la corsia 6 mostra il siero umano normale, la corsia 7 mostra il siero di un paziente con la malattia di Creutzfeldt-Jakob, la corsia 8 mostra un estratto di cervello umano normale e la corsia 9 mostra la proteina prionica purificata dal cervello di un paziente con la malattia di Creutzfeldt-Jakob.
La scoperta che le macchie 30-kd del liquido cerebrospinale (proteine 130 e 131) sono proteine 14-3-3 ha portato allo sviluppo di un semplice test immunologico per aiutare la diagnosi dell’encefalopatia spongiforme trasmissibile. Come mostra la figura 2, nel liquido cerebrospinale di pazienti con la malattia di Creutzfeldt-Jakob, c’era una banda immunoreattiva 30-kd (corsie 2 e 3), mentre nessuna banda simile è stata rilevata nel liquido cerebrospinale di controlli sani (dati non mostrati) o di un paziente con la malattia di Alzheimer (corsia 1). Come previsto, 14-3-3 era abbondante in un estratto di cervello umano normale (corsia 8). la proteina 14-3-3 non è stata trovata nel siero normale (corsia 6); tuttavia, non è stato rilevato anche nel siero di pazienti con malattia di Creutzfeldt-Jakob (corsia 7). La proteina prionica purificata dal cervello di un paziente con la malattia di Creutzfeldt-Jakob (corsia 9) non ha avuto una reazione incrociata con l’anticorpo 14-3-3, confermando che 14-3-3 non è una proteina prionica.
Tabella 1.
Tabella 1. Campioni di fluido cerebrospinale valutati con il 14-3-3 Immunoassay, secondo la diagnosi. Tabella 2.
Tabella 2. Sensibilità e specificità del test immunologico 14-3-3 per la malattia di Creutzfeldt-Jakob.
Sessantotto dei 71 campioni di liquido cerebrospinale di pazienti con la malattia di Creutzfeldt-Jakob (96%) erano positivi al 14-3-3 (Tabella 1 e Tabella 2). Quattro di 94 campioni (4 per cento) da pazienti con altre malattie che coinvolgono la demenza erano positivi per 14-3-3 (Tabella 1 e Tabella 2) (P<0.001). Inoltre, quando i pazienti con demenza noti per aver avuto infarti acuti del cervello entro un mese prima del test sono stati esclusi dall’analisi, solo 1 di 91 campioni (1 per cento) era positivo (P<0,001). I campioni da tutti i 10 pazienti con demenza multinfartuale ma senza ictus nel mese prima del test erano negativi per il 14-3-3. Il singolo risultato falso positivo tra i campioni di liquido cerebrospinale degli altri pazienti con demenza proveniva da un paziente con una diagnosi clinica di malattia di Alzheimer che non era stata verificata da studi patologici.
14-3-3 è stato rilevato in 18 dei 66 campioni di liquido cerebrospinale (27%) da pazienti con altre malattie neurologiche che non comportano demenza. I 18 campioni positivi provenivano da pazienti con encefalite virale acuta, ictus (senza demenza) entro un mese prima del test, emorragia subaracnoidea o sindrome di Rett. La malattia di Creutzfeldt-Jakob non potrebbe ragionevolmente essere inclusa nella diagnosi differenziale di nessuno di questi disturbi.
In generale, la sensibilità dell’immunodosaggio 14-3-3 come marcatore per la malattia di Creutzfeldt-Jakob era del 96 per cento (68 risultati veri positivi divisi da 71 risultati veri positivi e falsi negativi; intervallo di confidenza del 95 per cento, 92-99 per cento), e la specificità era dell’88 per cento (164 risultati veri negativi divisi da 186 risultati veri negativi e falsi positivi; intervallo di confidenza del 95 per cento, 84-92 per cento). Più importante, la specificità di questo test tra tutti i pazienti con demenza era del 96 per cento (90 risultati veri negativi divisi da 94 risultati veri negativi e falsi positivi; intervallo di confidenza del 95 per cento, 90 a 96 per cento), e quando i tre pazienti con demenza e infarto del cervello entro un mese prima del test sono stati esclusi, la specificità del test immunologico era del 99 per cento (90 risultati veri negativi divisi da 91 risultati veri negativi e falsi positivi; intervallo di confidenza del 95 per cento, 97 a 100 per cento) (Tabella 1 e Tabella 2).
Confronto tra elettroforesi bidimensionale e immunodosaggio
Tabella 3.
Tabella 3. Confronto dell’elettroforesi bidimensionale per le proteine 130 e 131 e il test immunologico 14-3-3.
Abbiamo confrontato il test elettroforetico bidimensionale per le proteine 130 e 131 con l’immunodosaggio 14-3-3 in 50 campioni di liquido cerebrospinale (tabella 3). Tredici dei 15 campioni di pazienti con la malattia di Creutzfeldt-Jakob erano positivi con entrambi i test, e gli altri 2 campioni erano negativi per le proteine 130 e 131 ma positivi per la proteina 14-3-3. I risultati dei due test erano gli stessi in campioni di pazienti con demenze non associate alla malattia di Creutzfeldt-Jakob o ad altri disturbi neurologici. Sebbene le specificità dei due test siano simili, l’immunodosaggio 14-3-3 ha una sensibilità leggermente superiore.
14-3-3 Immunoassay in Animals
Tabella 4.
Tabella 4. Risultati del test immunologico 14-3-3 in campioni di fluido cerebrospinale di animali.
I risultati degli studi sugli animali erano coerenti con quelli degli studi sugli esseri umani. La Figura 2 mostra i risultati del test nel fluido cerebrospinale di una mucca normale (corsia 4) e di una mucca con evidenza patologica di encefalopatia spongiforme trasmissibile (corsia 5). Come mostra la tabella 4, la proteina 14-3-3 è stata rilevata nel liquido cerebrospinale di sei dei nove bovini con encefalopatia viscosa trasmissibile indotta sperimentalmente o scrapie. L’unica mucca con caratteristiche cliniche ma nessuna evidenza patologica di encefalopatia spongiforme trasmissibile aveva anche un test positivo. Nessun bovino di controllo aveva un test positivo. Il test era positivo in cinque delle sei pecore con scrapie acquisita naturalmente ed era negativo nell’unica pecora di controllo. Tutti i 15 scimpanzé infettati sperimentalmente avevano test positivi, mentre nessuno dei 77 scimpanzé di controllo li aveva. La sensibilità complessiva dell’immunodosaggio 14-3-3 negli animali era dell’87% e la specificità complessiva era del 99%.