- I sistemi di cromatografia liquida in tandem a quadrupolo
- Sviluppo del metodo di estrazione in fase solida
- La stabilità del diazepam e del nordiazepam in campioni acquosi acidi e neutri
- I recuperi dell’estrazione in fase solida per campioni di acqua ambientale simulati, conservati a basso pH del campione
- Rigenerazione del nordiazepam durante la preparazione del campione
- Convalida del metodo
- Quantificazione di diazepam e nordiazepam in campioni di acqua ambientale
I sistemi di cromatografia liquida in tandem a quadrupolo
I sistemi di eluizione isocratica e gradiente sviluppati hanno dato una buona risoluzione dei picchi (Rs ≥ 3,1) per diazepam e nordiazepam. Nel sistema isocratico, i tempi di ritenzione erano 2,6 min (0,54 RSD %) e 4,1 min (0,27 RSD %) per gli standard di nordiazepam-d5 e diazepam-d5, rispettivamente. Nella matrice di acqua superficiale, i tempi di ritenzione erano gli stessi degli standard e i valori RSD erano 0,62% e 0,30% per nordiazepam-d5 e diazepam-d5, rispettivamente. I tempi di ritenzione per gli standard di lavoro nel sistema a gradiente erano 2,4 min (0,90 RSD %) e 2,9 min (0,70 RSD %) rispettivamente per nordiazepam e diazepam. La precisione dei tempi di ritenzione per i composti nelle acque reflue trattate sono riportati nella tabella 1, dove i valori RSD erano ≤ 0,35%.
Diazepam e nordiazepam sono stati identificati nei campioni di acque reflue trattate dalle loro caratteristiche transizioni MS/MS e tempi di ritenzione (tabella 1). Uno ione precursore e due ioni frammento sono stati monitorati per ogni composto. Per l’identificazione di diazepam e nordiazepam presenti in natura, i rapporti delle aree dei picchi ottenuti dai due ioni frammento sono stati confrontati con quelli degli standard (Tabella 1). Inoltre, i tempi di ritenzione dei composti target sono stati confrontati con i tempi di ritenzione del diazepam-d5 e del nordiazepam-d5 nella stessa corsa cromatografica.
Sviluppo del metodo di estrazione in fase solida
La stabilità del diazepam e del nordiazepam in campioni acquosi acidi e neutri
I campioni di acqua ambientale raccolti vengono comunemente conservati a pH acido prima di analizzare i contaminanti emergenti. Nel presente studio, è stata studiata la stabilità del diazepam e del nordiazepam se conservati come standard di lavoro (a pH 3.1 e pH 7.0). È stato riscontrato che il nordiazepam è stato ampiamente degradato quando conservato nella soluzione acida a temperatura ambiente. Entro 12 giorni, il 56% del nordiazepam era degradato (Fig. 2). La degradazione non era così estesa quando la soluzione di lavoro era conservata a 4 °C; dopo 12 giorni, il 20% della concentrazione iniziale di nordiazepam era degradato. D’altra parte, il diazepam è risultato stabile a pH 3,1 quando conservato a temperatura ambiente e a 4 °C (Fig. 2). Entro i 12 giorni, solo lo 0,53% e il 3,1% del diazepam sono stati degradati a temperatura ambiente e a 4 °C, rispettivamente. Entrambi i composti hanno dimostrato di essere stabili per 12 giorni a pH neutro. Al giorno 12, le risposte per diazepam e nordiazepam (quando conservati a 4 °C e a temperatura ambiente) erano 101-103% delle risposte iniziali. I valori RSD (n = 3) per la concentrazione determinata in diversi punti temporali erano ≤ 5,1%. La reazione è stata inizialmente scoperta in campioni di acque reflue, ma gli esperimenti sono stati eseguiti in soluzioni preparate per semplificare le condizioni e ridurre la possibilità di altre reazioni/effetti nelle matrici molto complesse delle acque reflue.
La stabilità di diazepam e nordiazepam in acido formico 5 mM in acqua purificata, pH 3. Diazepam conservato a 4 °C (triangolo bianco) e a temperatura ambiente (triangolo nero). Nordiazepam conservato a 4 °C (quadrato bianco) e a temperatura ambiente (quadrato nero). I dettagli sperimentali sono descritti in “Studi di stabilità di diazepam e nordiazepam in soluzioni acquose acide e neutre”
I nostri risultati mostrano che nordiazepam è instabile a pH 3, questi risultati sono in accordo con i risultati in letteratura che mostrano che nordiazepam subisce idrolisi in soluzioni acide. Archontaki et al. hanno scoperto che il nordiazepam viene idrolizzato in soluzioni acquose acide e che il primo passo della degradazione è reversibile. Tuttavia, i risultati del presente studio possono sembrare contrari ai risultati di uno studio recente in cui si è scoperto che il nordiazepam (e il diazepam) erano più stabili a pH 2 che a pH 7. La differenza è in realtà attesa se si considerano le diverse strategie per la determinazione del recupero. Poiché la trasformazione del nordiazepam viene invertita durante l’evaporazione e il riscaldamento, potrebbe non esserci alcuna implicazione pratica per l’uso di routine del metodo. È solo quando il recupero viene stimato secondo le raccomandazioni di Matuszewski et al. in combinazione con l’instabilità del nordiazepam a basso pH che si ottiene una perdita del composto e quindi un apparente recupero elevato.
I recuperi dell’estrazione in fase solida per campioni di acqua ambientale simulati, conservati a basso pH del campione
I recuperi dell’estrazione in fase solida e l’effetto matrice sono stati determinati in campioni di acqua trattati mediante LC-MS utilizzando l’approccio suggerito da Matuszewski et al. I recuperi di estrazione sono stati determinati per gli standard marcati con isotopi, diazepam-d5 e nordiazepam-d5, poiché non ci si aspetta che i composti marcati si trovino nelle matrici ambientali. Nel presente studio, gli standard di lavoro di diazepam-d5 e nordiazepam-d5 sono stati conservati in 5 mM di acido formico in acqua purificata pH 3.1/acetonitrile (90/10, v/v), per non più di 1 settimana a 8 °C, e sono stati utilizzati per preparare i set A-C.
I recuperi di estrazione relativi, determinati a una concentrazione bassa e una alta, sono riportati nella tabella 2 (il metodo di estrazione è riportato in “Preparazione del campione ed estrazione in fase solida”). I recuperi di estrazione erano più alti per il nordiazepam-d5 che per il diazepam-d5. Per il nordiazepam-d5, i recuperi relativi di estrazione erano 114 ± 8,1% e 117 ± 21% alla concentrazione bassa e alta, rispettivamente. I valori di RSD ottenuti per il diazepam-d5 erano 6,0% e 24% per la concentrazione bassa e alta, rispettivamente (tabella 2). Valori elevati di RSD (≥ 18%) per la procedura di estrazione in fase solida sono talvolta ottenuti nelle determinazioni a livello di tracce in matrici complesse. Inoltre, alti recuperi di estrazione (≥ 100%) per nordiazepam in campioni di acqua ambientale sono stati riportati in letteratura in precedenza. Come verrà discusso in seguito, gli alti recuperi potrebbero essere correlati a un equilibrio chimico tra nordiazepam e un prodotto di trasformazione.
Il recupero assoluto di estrazione per il nordiazepam-d5 è stato determinato al 139 ± 21% e l’effetto matrice al 119 ± 3,0%. L’elevato recupero assoluto dell’estrazione per il nordiazepam-d5 può essere in parte spiegato dal fatto che il nordiazepam-d5 è stato sottoposto a potenziamento ionico nell’interfaccia MS. Tuttavia, abbiamo dimostrato che gli alti recuperi di estrazione (> 100% per l’estrazione relativa, come discusso sopra) non erano solo causati da effetti matrice nella fonte ESI. Questo è stato determinato dai recuperi di estrazione relativi ottenuti secondo Matuszewski et al. dove i campioni estratti e non estratti sono stati iniettati nel sistema LC-MS/MS sciolto nella stessa matrice. Inoltre, per verificare ulteriormente che gli alti recuperi di estrazione non erano correlati a qualsiasi processo nell’interfaccia dello spettrometro di massa, i recuperi di estrazione per diazepam-d5 e nordiazepam-d5 sono stati determinati dall’uso di una seconda tecnica di rilevamento, LC-UV. Il recupero per un campione estratto di nordiazepam-d5 in tampone fosfato (pH 7,0) analizzato con entrambi LC-MS/MS e LC-UV è stato determinato per essere 159 e 153% (n = 2), rispettivamente. Abbiamo concluso che gli alti recuperi di estrazione per nordiazepam non sono stati attribuiti, in larga misura, a qualsiasi processo nello spettrometro di massa.
In conclusione, anche se i recuperi di estrazione ottenuti e i valori RSD erano alti, probabilmente appaiono come ragionevole come le concentrazioni dei composti target erano bassi (50 e 250 pM) e perché i composti sono stati estratti da una matrice complessa. In questo studio, abbiamo voluto dimostrare che questi alti recuperi ottenuti per il nordiazepam potrebbero essere correlati a un equilibrio chimico tra il nordiazepam e un prodotto di trasformazione trovato da Archontaki et al.
Rigenerazione del nordiazepam durante la preparazione del campione
Quando le soluzioni conservate di diazepam e nordiazepam (pH 3.1, a temperatura ambiente, “The stability of diazepam and nordiazepam in acid and neutral aqueous samples”) sono state utilizzate per picchettare il tampone fosfato e poi sottoposte a estrazione in fase solida, le risposte ottenute dagli estratti ricostituiti di nordiazepam erano maggiori rispetto alle risposte ottenute dalle soluzioni conservate non estratte. Con l’estrazione in fase solida, l’area del picco di nordiazepam era aumentata da 26 conteggi di area (2,7 RSD %, n = 3) a 45 conteggi di area (14,6 RSD %, n = 3).
Per verificare che il nordiazepam fosse rigenerato durante l’estrazione in fase solida, un campione conservato di nordiazepam-d5 (che dava un’area di picco di 1470 per lo ione frammento di m/z 213) e un campione trattato di nordiazepam-d5 (con un’area di picco di 1790) sono stati iniettati nel sistema LC-MS/MS. Oltre al canale SRM di nordiazepam-d5 (276 → 213), sono stati acquisiti altri due canali SRM, Tabella 1. I campioni conservati di nordiazepam-d5 sono stati iniettati (n = 6) e i rapporti delle transizioni SRM sono stati determinati per essere 1,4 (3,8 RSD %, rapporto ione frammento di m/z (276 → 213)/(276 → 165) e 1,0 (3,5 RSD %, rapporto ione frammento di m/z (276 → 213)/(276 → 140). Per il campione trattato di nordiazepam-d5, i rapporti delle transizioni SRM erano gli stessi, cioè 1,4 e 1,0. Quindi, non c’erano differenze significative nei rapporti degli ioni frammento tra i campioni conservati e quelli trattati. Inoltre, i tempi di ritenzione erano gli stessi per entrambi i campioni. Si è concluso che era il nordiazepam-d5 ad essere rilevato sia nei campioni conservati che in quelli trattati.
Archontaki et al. hanno scoperto che il nordiazepam è stato trasformato in soluzione acquosa acida, nell’intermedio N-(2-benzoyl-4-chlorophenyl)-2-aminoacetamide con la formula molecolare C15H13N2O2Cl e la massa monoisotopica 288,1 Da. Il prodotto di trasformazione è stato cristallizzato e analizzato mediante LC-UV, GC-MS, 1H- e 13C-NMR, e spettroscopia IR. L’equilibrio chimico dell’intermedio e del nordiazepam era reversibile, ma l’ulteriore trasformazione dell’intermedio nel prodotto finale di degradazione (C13H10NOCl) non era tuttavia reversibile. Nel presente studio, uno ione con un tempo di ritenzione di 3,0 min e un rapporto massa/carica di 289,0 è stato rilevato dalla LC-MS in una soluzione conservata (pH 3,1) di nordiazepam. Questo ione potrebbe corrispondere a + del prodotto di trasformazione del nordiazepam. Inoltre, il modello isotopico per lo ione a 3,0 min corrispondeva al modello isotopico per un atomo di cloro. Inoltre, il picco cromatografico ha eluito prima di nordiazepam, il che è in accordo con i risultati delle separazioni di nordiazepam e N-(2-benzoyl-4-chlorophenyl)-2-aminoacetamide nel sistema a fase inversa usato da Archontaki et al. Quindi, il picco rilevato nella soluzione di acqua acida conservata, in questo studio, era molto probabilmente N-(2-benzoyl-4-chlorophenyl)-2-aminoacetamide. Inoltre, il rapporto dell’area di picco di nordiazepam a N-(2-benzoyl-4-chlorophenyl)-2-aminoacetamide era 0,75 (n = 2) in questa soluzione di acqua conservata nello studio presentato. Nelle miscele di metanolo evaporato (dettagli sperimentali descritti in “Studi di stabilità di diazepam e nordiazepam in soluzioni acquose acide e neutre”), il rapporto dell’area del picco di nordiazepam a N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamide è tuttavia aumentato a 1,9 (6,8 RSD %, n = 4), cioè, l’area del picco del nordiazepam è aumentata e l’area del picco della N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamide è diminuita rispetto al campione che non è stato evaporato. Nessun picco è stato rilevato per N-(2-benzoyl-4-chlorophenyl)-2-aminoacetamide o nordiazepam nel campione vuoto. Questi risultati suggeriscono fortemente che l’equilibrio chimico di nordiazepam e il prodotto di trasformazione di nordiazepam, caratterizzato da Archontaki et al. si è spostato da N-(2-benzoyl-4-chlorophenyl)-2-aminoacetamide per formare nordiazepam durante l’evaporazione degli estratti SPE. Non è stato rilevato alcun picco che potesse essere correlato al prodotto di degradazione finale (C13H10NOCl) del nordiazepam.
Si è concluso che il nordiazepam è stato facilmente trasformato in N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamide nella soluzione di acqua acida. È interessante notare che il nordiazepam è stato rigenerato durante il processo di estrazione in fase solida. Pertanto, utilizzando le soluzioni conservate di nordiazepam a pH 3.0 come riferimento nei calcoli dei recuperi di estrazione, i recuperi di estrazione sono sovrastimati. Questi risultati sono importanti durante la convalida del metodo, cioè durante le valutazioni delle condizioni di conservazione, dei recuperi di estrazione e degli effetti della matrice. Inoltre, la trasformazione del nordiazepam potrebbe influenzare i risultati analitici complessivi se un analogo del nordiazepam marcato con isotopi non viene utilizzato come standard interno. Si deve anche sottolineare che la trasformazione del nordiazepam potrebbe influenzare la precisione del metodo, non solo durante la conservazione prima dell’estrazione in fase solida, ma anche a seconda del pH della soluzione utilizzata, ad esempio, la ricostituzione degli estratti SPE essiccati.
Convalida del metodo
Il metodo sviluppato è stato convalidato utilizzando gli analoghi marcati con isotopi, diazepam-d5 e nordiazepam-d5 (“Convalida del metodo”), poiché questi composti non erano rilevati nei campioni ambientali. Il vantaggio di utilizzare gli analoghi marcati per la validazione del metodo è che il metodo può essere convalidato a livelli di tracce nella matrice reale in cui gli analiti sono quantificati. I recuperi relativi di estrazione nei campioni di acque reflue trattate erano ≥ 87% per diazepam-d5 e nordiazepam-d5 ad alta e bassa concentrazione (Tabella 3). I valori ottenuti sono negli intervalli di ciò che ci si può aspettare quando concentrazioni di farmaci a livello di tracce vengono estratte da matrici complesse. I recuperi assoluti di estrazione sono stati più bassi, 63-86%, poiché gli analiti sono stati sottoposti a soppressione ionica (Tabella 3). Alla bassa concentrazione, gli effetti matrice (ME %) erano 76 ± 14% e 88 ± 14% per diazepam-d5 e nordiazepam-d5, rispettivamente (Tabella 3). Alla concentrazione elevata, l’effetto della matrice e i valori RSD erano nella stessa gamma come alla bassa concentrazione. Queste cifre di ME % rientrano nell’intervallo accettabile, poiché i risultati di altri studi dimostrano che l’effetto matrice ottenuto con matrici di acqua ambientale può essere relativamente elevato. L’accuratezza del metodo è stata determinata dalla determinazione dei recuperi SPE alla bassa e all’alta concentrazione di diazepam-d5 e nordiazepam-d5 (tabella 3). I recuperi relativi erano 88 ± 7,6% e 87 ± 12% per il diazepam-d5 alla concentrazione bassa e alta, rispettivamente, e 98 ± 7,8% e 99 ± 6,1% per il nordiazepam-d5.
La precisione del sistema cromatografico, espressa come valori RSD dei tempi di ritenzione ottenuti per diazepam-d5 e nordiazepam-d5 in campioni di acque reflue estratte, era ≤ 0,62%. I valori RSD delle aree dei picchi per il diazepam-d5 e il nordiazepam-d5 nei campioni di acque reflue estratti erano ≤ 7,8% (“I sistemi di spettrometria di massa a quadrupolo tandem in cromatografia liquida”). Inoltre, la linearità, espressa come il coefficiente di correlazione (R2) delle curve di calibrazione nei campioni di acque reflue trattate, era 0.988 e 0.957 per diazepam e nordiazepam, rispettivamente.
Nessun carryover nel sistema LC-MS/MS è stato osservato in questo studio come nessun picco degli analiti o dei composti marcati con isotopi sono stati rilevati in uno dei campioni di acqua Millipore purificati iniettati. Non c’era alcuna indicazione che qualsiasi contaminazione incrociata si è verificato durante la manipolazione del campione o l’estrazione in fase solida come i campioni di tampone fosfato estratti non contenevano nessuno dei composti di destinazione. Il rischio di ottenere risultati falsi positivi a seguito di autocontaminazione è stato quindi considerato ridotto al minimo in questo studio.
Il LOQ e LOD per diazepam-d5 e nordiazepam-d5 sono stati determinati in campioni di acque reflue trattate. I limiti di quantificazione sono stati fissati a 5,0 pM (1,4 ng L-1) sia per il diazepam-d5 che per il nordiazepam-d5 dove i rapporti segnale-rumore erano circa 10 e la precisione ottenuta era 12,7 e 15,9 RSD % (n = 3) per i rispettivi composti (tabella 3), cioè entro la precisione stabilita del 20%. I valori di LOQ ottenuti nel presente studio sono nella gamma di ciò che è stato raggiunto in altri studi per diazepam e nordiazepam in campioni di acque reflue trattate. Tuttavia, in quello studio, è stato estratto un volume di 200 mL di acque reflue trattate, in confronto a 75 mL nel nostro metodo presentato. I limiti di rilevamento erano 1,7 pM (0,49 ng L-1) e 2,0 pM (0,55 ng L-1) per diazepam-d5 e nordiazepam-d5, rispettivamente (Tabella 3).
Come discusso sopra (“La stabilità di diazepam e nordiazepam in campioni acquosi acidi e neutri,” Fig. 2), diazepam e nordiazepam hanno dimostrato di essere stabile per 12 giorni ad un pH campione di 7.0 se conservati a temperatura ambiente o a 4 °C.
Quantificazione di diazepam e nordiazepam in campioni di acqua ambientale
Il metodo LC-MS/MS sviluppato è stato applicato a campioni di acqua ambientale per la determinazione di diazepam e nordiazepam. Va sottolineato che il metodo sviluppato può essere impiegato per le determinazioni di diazepam e nordiazepam in campioni ambientali in condizioni acide se ai campioni vengono aggiunti standard interni ideali prima della conservazione, cioè composti marcati con isotopi dei composti target. In questo studio, i composti marcati con isotopi, diazepam-d5 e nordiazepam-d5, sono stati utilizzati come standard interni per compensare la potenziale trasformazione dei composti e altre perdite nonché le variazioni durante l’analisi. Non ci sono state differenze significative, al livello del 5% in un test t, tra i rapporti di ioni ottenuti per le soluzioni standard (tabella 1) e quelli ottenuti per il diazepam o il nordiazepam presenti “naturalmente” (P ≥ 0,07). Le concentrazioni di diazepam e nordiazepam sono state determinate rispettivamente a 8,5 (2,4 ng L-1) e 66 pM (18 ng L-1). Nei campioni dello stesso impianto di trattamento delle acque reflue raccolti 14 giorni dopo, le concentrazioni sono state determinate a 7,5 (2,1 ng L-1) e 75 pM (20 ng L-1) per diazepam e nordiazepam, rispettivamente. Così, le concentrazioni di nordiazepam sono state determinate per essere circa un ordine di grandezza superiore a quelle per il diazepam. Questi risultati sono in accordo con i risultati di altri studi sugli effluenti delle acque reflue. Inoltre, in alcuni campioni di acque reflue trattate, riportati in letteratura, il nordiazepam è stato quantificato, ma il diazepam non è stato rilevato. Nel presente studio, né il diazepam né il nordiazepam sono stati rilevati nelle acque superficiali raccolte dal fiume Fyris, 3 km a monte dell’impianto di trattamento delle acque reflue Kungsängsverket, indicando poche emissioni di acque reflue antropogeniche a monte.