L’etichettatura 18O: uno strumento per la proteomica

Viene presentata una valutazione dell’etichettatura proteolitica e della quantificazione delle proteine per scopi diagnostici usando tripsina e H2O arricchita con 18O. Dimostriamo che la quantificazione comparativa o relativa può essere eseguita efficacemente con questo approccio. Abbiamo sviluppato un protocollo che permette la conservazione dei peptidi etichettati in acqua abbondanza naturale senza timore di back-exchange fornendo che il pH è sufficientemente basso per spegnere l’attività catalitica della tripsina, ma non così basso da promuovere chimica back-exchange. Poiché l’efficienza di etichettatura dipende dalla natura del peptide, una semplice relazione lineare tra il contenuto relativo 16O/18O della miscela tampone digerente (x) e l’efficienza di etichettatura (y) non esiste; piuttosto segue una probabilità basata y = x(2) relazione. Come tale, il grado di etichettatura del peptide utilizzando 16O/18O digerire rapporti miscela tampone può deviare significativamente da quello previsto sulla base di una relazione lineare. La valutazione dell’efficienza relativa Ziptip indicato una perdita di recupero del campione come la concentrazione del peptide è stato ridotto utilizzando condizioni normali, suggerendo che c’è un limite sotto il quale ci sono rendimenti decrescenti. Inoltre, le perdite adsorbitive a causa di Speedvac asciugare e recupero indicato modeste (20%) perdite che possono variare ampiamente (0-50%) da peptide a peptide. L’efficienza di digestione in soluzione di miscele di proteine standard in funzione della concentrazione ha rivelato una diminuzione lineare con concentrazione decrescente. Questo è coerente con gli effetti cinetici dell’enzima e sottolinea un potenziale errore di quantificazione che potrebbe sorgere quando si valuta l’espressione differenziale basato sulla rilevazione del peptide. I risultati dei nostri studi dimostrano il potere dell’etichettatura 18O come strumento di ottimizzazione per lo sviluppo del processo di proteomica.