Abstract
La glicogeno fosforilasi è un enzima importante per il metabolismo dei carboidrati nei muscoli. Utilizza il fosfato inorganico per rimuovere il glucosio dal glicogeno, producendo glucosio-1-fosfato, che può essere utilizzato per la produzione di ATP. La glicogeno fosforilasi inattiva (fosforilasi h) è attivata dal legame allosterico del 5′-AMP o dalla fosforilazione da parte della fosforilasi chinasi (PhK). La fosforilazione produce la fosforilasi a, che è attiva in assenza di AMP. PhK è l’unica chinasi che può fosforilare la fosforilasi b, che a sua volta è l’unico substrato per PhK. Questa ricerca di dissertazione ha cercato di determinare le ragioni di questa specificità e come questi due enzimi si riconoscono a vicenda, studiando i mutanti site-directed della fosforilasi del glicogeno; tutti i mutanti sono stati analizzati per i cambiamenti nella loro interazione con una forma troncata della subunità catalitica della fosforilasi chinasi, gamma(1–300). Tre mutazioni (R69K, R69E e E501A), effettuate in siti che interagiscono con il terminale amminico della fosforilasi b o a, hanno mostrato poche differenze nella fosforilazione da parte di gamma(1–300) rispetto alla fosforilasi b. Cinque mutazioni, fatte a tre siti nella coda amino-terminale della fosforilasi (K11A, K11E, I13G, R16A, e R16E), tuttavia, hanno prodotto diminuzioni dell’efficienza catalitica per gamma(1–300), rispetto alla fosforilasi b. R16E era il substrato più povero per gamma(1–300), dando una diminuzione di 47 volte dell’efficienza catalitica. L’amino-terminale, e specialmente Arg 16, sono fattori molto importanti per il riconoscimento della fosforilasi da parte di gamma(1–300). Inoltre, I13G e R16A sono stati in grado di essere fosforilati dalla protein chinasi A, che non riconosce la fosforilasi nativa. R16A e R16E sono stati attivati a una concentrazione molto bassa di AMP e cristallizzati a bassa temperatura, come la fosforilasi a. Questo indica che anche senza fosforilazione, le loro strutture sono più simili alla fosforilasi a che alla fosforilasi b. Altri due mutanti hanno prodotto l’effetto opposto, comportandosi come la fosforilasi b dopo la fosforilazione. R69E era solo parzialmente attivato dalla fosforilazione, e I13G era completamente inattivo dopo la fosforilazione. I13G è stata la prima osservazione di una forma di fosforilasi che non poteva essere attivata dalla fosforilazione.