Lo scambio H-D fu misurato originariamente dal padre dello scambio di idrogeno Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang usando tubi a gradiente di densità. In tempi moderni, lo scambio H-D è stato principalmente monitorato dai metodi: Spettroscopia NMR, spettrometria di massa e cristallografia a neutroni. Ognuno di questi metodi ha i suoi vantaggi e svantaggi.
Spettroscopia NMRModifica
I nuclei di idrogeno e deuterio sono enormemente diversi nelle loro proprietà magnetiche. Così è possibile distinguerli con la spettroscopia NMR. I deuteroni non saranno osservati in uno spettro 1H NMR e viceversa, i protoni non saranno osservati in uno spettro 2H NMR. Quando si osservano piccoli segnali in uno spettro 1H NMR di un campione altamente deuterato, questi vengono definiti segnali residui. Possono essere usati per calcolare il livello di deuterazione in una molecola. Segnali analoghi non vengono osservati negli spettri NMR 2H a causa della bassa sensibilità di questa tecnica rispetto all’analisi 1H. I deutoni mostrano tipicamente spostamenti chimici molto simili ai loro protoni analoghi. L’analisi tramite la spettroscopia NMR 13C è anche possibile: i diversi valori di spin dell’idrogeno (1/2) e del deuterio (1) danno luogo a diverse multiplicità di scissione. La spettroscopia NMR può essere usata per determinare la deuterazione sito-specifica delle molecole.
Un altro metodo usa gli spettri HSQC. Tipicamente gli spettri HSQC sono registrati in una serie di punti temporali mentre l’idrogeno sta scambiando con il deuterio. Poiché l’esperimento HSQC è specifico per l’idrogeno, il segnale decadrà esponenzialmente mentre l’idrogeno si scambia. È quindi possibile adattare una funzione esponenziale ai dati e ottenere la costante di scambio. Questo metodo fornisce informazioni specifiche per tutti i residui della proteina simultaneamente. Lo svantaggio principale è che richiede un’assegnazione preliminare dello spettro per la proteina in questione. Questo può essere molto laborioso e di solito limita il metodo a proteine più piccole di 25 kDa. Perché ci vogliono minuti a ore per registrare uno spettro HSQC, ammidi che scambio rapidamente devono essere misurati utilizzando altre sequenze di impulsi.
Spettrometria di massaModifica
Spettrometria di massa di scambio idrogeno-deuterio può determinare il contenuto complessivo di deuterio di molecole che hanno subito lo scambio H/D. A causa della preparazione del campione richiesta, si ritiene in genere che fornisca una misurazione accurata solo degli atomi di idrogeno non scambiabili. Può anche comportare lo scambio H/D in fase gassosa o lo scambio in fase di soluzione prima della ionizzazione. Ha diversi vantaggi nella spettroscopia NMR rispetto all’analisi delle reazioni di scambio H-D: è necessario molto meno materiale, la concentrazione del campione può essere molto bassa (fino a 0,1 uM), il limite delle dimensioni è molto maggiore, e i dati possono essere solitamente raccolti e interpretati molto più rapidamente.
Il nucleo del deuterio è due volte più pesante del nucleo dell’idrogeno perché contiene un neutrone oltre a un protone. Così una molecola che contiene un po’ di deuterio sarà più pesante di una che contiene tutto idrogeno. Quando una proteina è sempre più deuterata, la massa molecolare aumenta di conseguenza. Rilevare il cambiamento nella massa di una proteina dopo la deuterazione è stato reso possibile dalla moderna spettrometria di massa delle proteine, riportata per la prima volta nel 1991 da Katta e Chait.
Determinare la deuterazione specifica del sito tramite la spettrometria di massa è più complicato che usare la spettroscopia NMR. Per esempio, la posizione e la quantità relativa dello scambio di deuterio lungo la spina dorsale del peptide possono essere determinati approssimativamente sottoponendo la proteina alla proteolisi dopo che la reazione di scambio è stata spenta. I singoli peptidi vengono poi analizzati per la deuterazione complessiva di ogni frammento peptidico. Con questa tecnica la risoluzione dello scambio di deuterio è determinata dalla dimensione dei peptidi prodotti durante la digestione. La pepsina, una proteasi acida, è comunemente usata per la proteolisi, poiché il pH di spegnimento deve essere mantenuto durante la reazione proteolitica. Per ridurre al minimo il back-exchange, la proteolisi e la successiva analisi in spettrometria di massa devono essere effettuate il più rapidamente possibile. La separazione HPLC del digest peptico è spesso effettuata a bassa temperatura appena prima della spettrometria di massa elettrospray per minimizzare il back-exchange. Più recentemente, UPLC è stato utilizzato a causa delle sue capacità di separazione superiore.
E ‘stato proposto nel 1999 che potrebbe essere possibile ottenere la risoluzione singolo residuo utilizzando collisione indotta dissociazione (CID) frammentazione di peptidi deuterati in combinazione con la spettrometria di massa tandem. Si scoprì presto che la CID causa lo “scrambling” della posizione del deuterio all’interno dei peptidi. Tuttavia, la frammentazione prodotta da MALDI in-source decay (ISD), dissociazione cattura dell’elettrone (ECD), e la dissociazione trasferimento di elettroni (ETD) procedere con poco o nessun scrambling in condizioni sperimentali corrette. Lo scrambling dell’etichettatura isotopica è causato dal riscaldamento collisionale prima della dissociazione dello ione e mentre il CID causa lo scrambling, il riscaldamento collisionale può avvenire anche durante la ionizzazione e il trasporto dello ione. Tuttavia, con un’attenta ottimizzazione dei parametri dello strumento che causano il riscaldamento degli ioni, lo scrambling dell’idrogeno può essere ridotto al minimo in modo da preservare l’etichettatura isotopica in fase di soluzione fino a quando la frammentazione può essere eseguita utilizzando una tecnica in cui lo scrambling non si verifica. Più recentemente, la fotodissociazione ultravioletta (UVPD) è stata anche studiata come una possibile tecnica di frammentazione per localizzare il deuterio all’interno di peptidi e proteine. A questo proposito, le conclusioni sono state miste, mentre è possibile ottenere frammenti UVPD che non ha subito scrambling in determinate condizioni, altri hanno dimostrato che scrambling può verificarsi per entrambi i peptidi e proteine durante il passo di frammentazione UVPD stesso. La teoria attuale che consolida queste apparenti contraddizioni ha a che fare con la doppia via di frammentazione che può derivare dall’irradiazione UV di peptidi e proteine, cioè la dissociazione diretta e statistica. Cioè, se le condizioni sperimentali favoriscono la dissociazione diretta e lo ione precursore è mantenuto a basse energie interne prima e durante la frammentazione, il livello di deuterio dei frammenti risultanti corrisponderà al precursore non frammentato. Tuttavia, le condizioni sperimentali possono favorire la dissociazione statistica durante l’irradiazione UV, specialmente con tempi di irradiazione lunghi e bassa pressione del gas, portando alla conversione interna dell’energia di eccitazione elettronica apportata dai fotoni UV. Il risultato è l’eccitazione vibrazionale della molecola irradiata che a sua volta subisce un rimescolamento.
Cristallografia neutronicaModifica
Lo scambio idrogeno-deuterio di specie a scambio rapido (per esempio gruppi idrossilici) può essere misurato alla risoluzione atomica in modo quantitativo dalla cristallografia neutronica, e in tempo reale se lo scambio è condotto durante l’esperimento di diffrazione.
Fasci di neutroni ad alta intensità sono generalmente generati per spallazione in acceleratori di particelle linac come la Spallation Neutron Source. I neutroni diffrangono i cristalli in modo simile ai raggi X e possono essere usati per la determinazione strutturale. Gli atomi di idrogeno, con un numero di elettroni compreso tra uno e zero in un ambiente biologico, diffrangono poco i raggi X e sono effettivamente invisibili in condizioni sperimentali normali. I neutroni si disperdono dai nuclei atomici, e sono quindi in grado di rilevare gli atomi di idrogeno e deuterio.
Gli atomi di idrogeno vengono abitualmente sostituiti con il deuterio, che introduce un fattore di dispersione forte e positivo. Spesso è sufficiente sostituire solo il solvente e gli atomi di idrogeno labili in un cristallo di proteina per diffusione del vapore. In una tale struttura l’occupazione di un atomo di deuterio scambiabile in un cristallo si affinerà da 0-100%, quantificando direttamente la quantità di scambio.