- Abstract
- Introduzione
- Pazienti e metodi
- Pazienti
- Caratteri e metodi microbiologici
- Agenti antimicrobici
- Amplificazione e sequenziamento del DNA delle regioni che determinano la resistenza al chinolone
- Rilevazione genetica dei geni delle metallo-β-lattamasi
- Preparazione delle proteine di membrana esterna
- Risultati
- Suscettibilità
- Resistenza ai fluorochinoloni
- Resistenza ai carbapenemi
- Discussione
- Note degli autori
Abstract
Obiettivi: Pseudomonas putida è un patogeno opportunistico non comune, solitamente suscettibile agli agenti antimicrobici. I dati riguardanti la resistenza agli agenti antimicrobici negli isolati clinici di P. putida sono limitati.
Pazienti e metodi: Le suscettibilità ai fluorochinoloni, ai carbapenemi e ad altri antibiotici sono state caratterizzate in cinque isolati clinici di P. putida recuperati da diversi pazienti con infezioni del tratto urinario come patogeni causali. La resistenza ai fluorochinoloni e ai carbapenemi è stata caratterizzata geneticamente con i metodi della PCR e del sequenziamento del DNA. I profili delle proteine della membrana esterna (OMP) sono stati caratterizzati da SDS-PAGE.
Risultati: Quattro dei cinque isolati erano resistenti o intermedi sia ai fluorochinoloni che ai carbapenemi. Le sequenze nucleotidiche nelle regioni che determinano la resistenza ai chinoloni hanno suggerito che mutazioni aminoacidiche come Thr-83→Ile in GyrA e Glu-469→Asp in GyrB possono contribuire all’alta resistenza ai fluorochinoloni. Quattro isolati produttori di metallo-β-lattamasi che hanno mostrato resistenza ai carbapenemi hanno portato i geni della metallo-β-lattamasi di tipo IMP. Un effetto combinato di produzione ridotta di 46 kDa OMP e produzione di metallo-β-lattamasi è stato mostrato da un isolato di P. putida che ha mostrato le più alte MIC di carbapenemi.
Conclusioni: Questo studio ha identificato i meccanismi di resistenza ai fluorochinoloni e ai carbapenemi negli isolati clinici di P. putida.
Introduzione
Pseudomonas putida, un bacillo Gram-negativo non fermentante, è un patogeno umano opportunistico responsabile di batteriemia e sepsi in pazienti neonatali, neutropenici e oncologici, nonché di infezioni del tratto urinario (UTI).1-4 Anche se non comune, P. putida può essere una causa di infezioni nosocomiali in ospiti compromessi.3
La maggior parte di P. putida è sensibile agli agenti antimicrobici come i carbapenemi, i fluorochinoloni e gli aminoglicosidi.5-7 Tuttavia, sono stati riportati isolati clinici di P. putida che producono metallo-β-lattamasi che conferiscono resistenza ai β-lattami, compresi i carbapenemi.3,4,8,9 Inoltre, isolati produttori di metallo-beta-lattamasi che hanno mostrato resistenza alla ciprofloxacina, gentamicina e tobramicina oltre ai β-lattamici sono stati recentemente riportati.3 L’emergenza di P. putida resistente a più farmaci è diventata una causa di difficoltà nel trattamento delle infezioni e rappresenta un rischio di trasmissione nosocomiale.
In alcuni studi precedenti, la resistenza agli antibiotici in P. putida è stata caratterizzata in relazione alla produzione di metallo-β-lattamasi e alle caratteristiche dei sistemi di efflusso.3,4,8-P. putida resistente ai carbapenemi produce frequentemente metallo-β-lattamasi di tipo IMP e VIM secondo quanto riportato da Europa, Corea e Giappone.3,4,8,9,9a Sistemi di efflusso come TtgABC, MepABC, TtgDEF e ArpABC possono anche contribuire alla resistenza a più farmaci in P. putida.10-12Pseudomonas aeruginosa ha la capacità di diventare rapidamente resistente nel corso del trattamento,13 sebbene non sia chiaro se P. putida abbia lo stesso potenziale. Per valutare il rischio che emerga la resistenza agli antibiotici, sono necessari dati abbondanti sulla resistenza agli agenti antimicrobici negli isolati clinici di P. putida. In questo studio, abbiamo determinato le suscettibilità agli agenti antimicrobici compresi i fluorochinoloni e i carbapenemi e caratterizzato i meccanismi di resistenza ai fluorochinoloni e ai carbapenemi, negli isolati clinici di P. putida recuperati come patogeni che causano UTI durante un periodo di 1 anno nel nostro ospedale.
Pazienti e metodi
Pazienti
Cinque pazienti (quattro maschi e una femmina) con diagnosi di UTI acute, ripetute o croniche causate da P. putida all’ospedale universitario di Hamamatsu sono stati inclusi nel nostro studio da ottobre 2001 a settembre 2002.
Caratteri e metodi microbiologici
I ceppi utilizzati in questo studio erano cinque isolati clinici di P. putida recuperati da diversi pazienti come patogeni causali. L’identificazione è stata eseguita tramite test biochimici standard nel nostro laboratorio di microbiologia clinica. Tutti gli isolati sono stati ottenuti dalle urine. I modelli dei frammenti limitati da SpeI del DNA cromosomico di questi cinque isolati variavano (Figura 1). I batteri sono stati conservati a -70°C in brodo di infusione cardiaca (Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Giappone) contenente il 20% di glicerolo. Successivamente, i batteri sono stati inoculati su piastre di agar per infusione di cuore (Nissui Pharmaceutical) e incubati a 37°C per una notte. Le MIC sono state determinate con un metodo di diluizione in agar come descritto dal Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), precedentemente il National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS).14 Il test di suscettibilità è stato eseguito utilizzando l’agar Mueller-Hinton (Nippon Becton Dickinson, Tokyo, Giappone) in conformità alle istruzioni del produttore. I criteri interpretativi della MIC per ceftazidima, imipenem, meropenem, norfloxacina, levofloxacina, gatifloxacina, gentamicina, amikacina e minociclina hanno seguito quelli del CLSI/NCCLS.14 I breakpoint MIC di altri agenti antimicrobici non erano definiti.
Agenti antimicrobici
Amplificazione e sequenziamento del DNA delle regioni che determinano la resistenza al chinolone
Il DNA cromosomico è stato estratto dagli isolati di P. putida come precedentemente descritto.15 L’amplificazione PCR è stata eseguita con set di primer specifici. Un set di primer 5′-gacggcctgaagccggtgcac-3′ e 5′-gcccacggcgataccgctgga-3′ ha amplificato un frammento di 417 bp delle regioni di determinazione della resistenza al chinolone (QRDRs) del gene gyrA dalle posizioni 115 a 531.16 Un set di primer 5′-agtacttcgccgacttcct-3′ e 5′-tacaggcgcgacaggcgctt-3′ ha amplificato un frammento di 739 bp delle QRDRs del gene gyrB dalle posizioni 1073 a 1811.17 Un set di primer 5′-tctacgccatgagcgaactgg-3′ e 5′-agcagcacctcggaatagcg-3′ ha amplificato un frammento di 262 bp del QRDRs del gene parC dalle posizioni 158 a 419.18 Le amplificazioni sono state effettuate con l’enzima Advantage-GC2 (BD Biosciences Clontech Japan, Tokyo, Giappone) secondo le istruzioni del produttore. I QRDR sono stati sequenziati utilizzando un kit di reazione pronta per il sequenziamento del ciclo BigDye terminator v3.0 Taq con AmpliTaq DNA polimerasi (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) e un sistema automatico di sequenziamento del DNA (analizzatore genetico ABI PRISM 310, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Rilevazione genetica dei geni delle metallo-β-lattamasi
Preparazione delle proteine di membrana esterna
Le proteine di membrana esterna (OMP) sono state preparate come precedentemente descritto.21 I campioni sono stati analizzati mediante SDS-PAGE.
Risultati
Suscettibilità
I risultati dei test di suscettibilità per fluorochinoloni e carbapenemi sono riassunti nelle tabelle 1 e 2, rispettivamente. Le MIC dei β-lattami variavano da >128 mg/L per l’ampicillina e la cefaloridina, da 2 a >128 mg/L per la ceftazidima, da 1 a 128 mg/L per l’imipenem, da 0,5 a >128 mg/L per il panipenem, da 4 a >128 mg/L per il meropenem e da 1 a >128 mg/L per il biapenem. Gli intervalli MIC degli aminoglicosidi e della minociclina erano i seguenti: 0,25 a 8 mg/L per la gentamicina, 0,5 a 8 mg/L per l’amikacina, 0,5 a 1 mg/L per la kanamicina e 4 a 64 mg/L per la minociclina. Quattro isolati erano resistenti o intermedi sia ai fluorochinoloni che ai carbapenemi, mentre un isolato, HU2001-429, era suscettibile sia ai β-lattami che ai fluorochinoloni. Tre isolati di P. putida, HU2001-412, HU2001-419 e HU2001-451, hanno mostrato resistenza a tutti i β-lattamici esaminati come ceftazidime, imipenem e meropenem. Tre isolati, HU2001-412, HU2001-419 e HU2002-467, hanno mostrato un’elevata resistenza ai fluorochinoloni (>128 mg/L), tra cui norfloxacina, levofloxacina, sparfloxacina, gatifloxacina e pazufloxacina, e anche alla minociclina (da 32 a 64 mg/L). Nei cinque isolati, l’intervallo MIC per la sitafloxacina era compreso tra ≤0,125 e 8 mg/L.
Resistenza ai fluorochinoloni
Resistenza ai carbapenemi
Dei cinque isolati di P. putida, quattro che mostravano resistenza ai carbapenemi portavano il gene della metallo-β-lattamasi di tipo IMP, mentre i geni della metallo-β-lattamasi di tipo VIM non erano rilevati dalla PCR (tabella 2). Gli intervalli MIC dei carbapenemi in P. putida che porta i geni della metallo-beta-lattamasi di tipo IMP erano i seguenti: da 8 a 128 mg/L per l’imipenem, da 32 a >128 mg/L per il panipenem, 128 mg/L o superiore per il meropenem e da 32 a >128 mg/L per il biapenem. In P. putida HU2001-451, che ha mostrato le più alte MIC di carbapenemi tra i cinque isolati, la produzione di 46 kDa OMP non era rilevabile tramite SDS-PAGE, mentre quelle di P. putida HU2001-412, HU2001-419, HU2001-429 e HU2002-467 sono state rilevate in modo simile (Tabella 2).
Discussione
In questo studio, abbiamo caratterizzato le suscettibilità ai fluorochinoloni e ai carbapenemi in cinque isolati clinici di P. putida isolati da diversi pazienti con UTI acuta, ripetuta o cronica. Tutti e cinque gli isolati hanno mostrato diversi genotipi PFGE, il che ha suggerito che nessuna delle infezioni causate da questi P. putida fosse nosocomiale. Quattro dei cinque isolati erano resistenti o intermedi sia ai fluorochinoloni che ai carbapenemi. Tre isolati hanno mostrato un’alta resistenza (>128 mg/L) a tutti i fluorochinoloni esaminati ad eccezione della sitafloxacina. Tra i fluorochinoloni esaminati in questo studio, la sitafloxacina ha mostrato una potenza superiore contro gli isolati di P. putida. Questi isolati altamente resistenti ai fluorochinoloni erano anche resistenti ai carbapenemi e alla minociclina. Tutti gli isolati erano suscettibili agli aminoglicosidi come l’amikacina.
Gli studi sulla resistenza al fluorochinolone in P. putida sono limitati.6,12 In P. aeruginosa, i principali meccanismi responsabili della resistenza al fluorochinolone includono mutazioni di aminoacidi nella DNA girasi o nella topoisomerasi IV causate da mutazioni nei QRDR di GyrA e ParC, mentre alcuni rapporti hanno suggerito il coinvolgimento di mutazioni di GyrB nella resistenza al fluorochinolone.18,22 Un meccanismo secondario di resistenza in P. aeruginosa che coinvolge i sistemi di efflusso contribuisce alla ridotta suscettibilità ai fluorochinoloni.22,23 In questo studio, le alterazioni degli aminoacidi nei QRDR di GyrA, GyrB e ParC sono state confrontate tra cinque isolati clinici di P. putida. P. putida resistente al fluorochinolone aveva mutazioni aggiuntive come Thr-83→Ile in GyrA e Glu-469→Asp in GyrB, che corrispondevano alle mutazioni trovate in P. aeruginosa resistente al fluorochinolone.22,23 Questi risultati indicano che le mutazioni aminoacidiche nei QRDR come Thr-83→Ile in GyrA e Glu-469→Asp in GyrB possono contribuire all’alta resistenza ai fluorochinoloni, anche se non è stato determinato se la trasformazione con plasmidi che portano i geni wild-type gyrA, gyrB o parC in tali isolati possa abbassare le MIC dei fluorochinoloni.24 Il range MIC della sitafloxacina era tra ≤0,125 e 8 mg/L per i cinque isolati di P. putida. Anche se rapporti precedenti hanno dimostrato che la sovraespressione dei sistemi di efflusso TtgABC, MepABC, TtgDEF e ArpABC può anche contribuire alla resistenza ai farmaci multipli in P. putida,10,11,12 il ruolo dei sistemi di efflusso è rimasto poco chiaro in questo studio.
È stata riportata la resistenza ai carbapenemi in P. putida causata dalla produzione di metallo-β-lattamasi.3,4,8,9,9a Queste metallo-β-lattamasi trovate in P. putida includevano i tipi IMP e VIM.3,4,8,9,9a Nei quattro P. putida resistenti ai carbapenemi, la produzione di metallo-β-lattamasi è stata rilevata con un metodo di diffusione a disco (dati non mostrati). Questi isolati hanno portato i geni della metallo-β-lattamasi di tipo IMP, mentre i geni della metallo-β-lattamasi di tipo VIM non sono stati rilevati dalla PCR. La prevalenza di P. putida produttore di metallo-beta-lattamasi è un importante problema clinico, che rappresenta un serbatoio di determinanti genetici della resistenza ai β-lattamici. In P. aeruginosa, altri importanti meccanismi di resistenza ai carbapenemi includono l’impermeabilità mutazionale derivante dalla perdita di OprD – un canale transmembrana che forma una porina accessibile ai carbapenemi ma non ad altri β-lattamici – oltre alla produzione di metallo-β-lattamasi.21,25,26 La perdita di OprD comporta la resistenza all’imipenem e una ridotta suscettibilità al meropenem in P. aeruginosa.27 In P. putida HU2001-451, che mostra le più alte MIC (≥128 mg/L) di tutti i carbapenemi tra i quattro isolati resistenti ai carbapenemi, la produzione di 46 kDa OMP era ridotta rispetto a quella di altri isolati. I profili OMP di P. putida HU2001-451 erano simili a quelli di P. aeruginosa resistente ai carbapenemi, in cui la produzione ridotta di OprD è stata identificata nel nostro studio precedente.21 Questi risultati hanno mostrato un effetto combinato della ridotta produzione di 46 kDa OMP che coesiste con la produzione di metallo-β-lattamasi sulla resistenza ai carbapenemi nell’isolato, anche se non è chiaro se altre β-lattamasi abbiano rilevanza sulla resistenza ai carbapenemi.
In conclusione, abbiamo caratterizzato la resistenza al fluorochinolone e ai carbapenemi in isolati clinici di P. putida. I nostri risultati indicano che le mutazioni aminoacidiche nei QRDR, come Thr-83→Ile in GyrA e Glu-469→Asp in GyrB, possono contribuire all’alta resistenza ai fluorochinoloni in P. putida. Quattro isolati di P. putida produttori di metallo-β-lattamasi che hanno mostrato resistenza ai carbapenemi hanno portato il gene della metallo-β-lattamasi di tipo IMP. Abbiamo trovato un effetto combinato della ridotta produzione di 46 kDa OMP e la produzione di metallo-β-lattamasi che ha aumentato la resistenza ai carbapenemi in un isolato di P. putida che ha mostrato le più alte MIC di carbapenemi.
Ringraziamo Miroku Medical Laboratory, Saku, Nagano, Giappone, per l’analisi PFGE. T. H. è supportato da un Grant-in-Aid for Scientific Research (17790353) dal Ministero dell’Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia del Giappone.
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Note degli autori
1Dipartimento di Medicina di Laboratorio, Scuola di Medicina dell’Università di Hamamatsu, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Giappone; 2Gruppo di Ricerca sul Controllo delle Infezioni, Scuola di Medicina dell’Università di Hamamatsu, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Giappone; 3Divisione di Farmacia, Scuola di Medicina dell’Università di Hamamatsu, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Giappone; 4Dipartimento di Medicina di Laboratorio Clinico, Scuola Superiore di Medicina, Università di Kyoto, 54 Shogoin-Kawahara-cho, Sakyo-ku, Kyoto 606-8507, Giappone
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