Costruzione della libreria di mutanti Tn5
I mutanti Tn5 sono stati generati dalla mutagenesi casuale utilizzando la PCR a rischio di errore sull’intera trasposasi Tn5 di tipo selvaggio (codice di adesione NCBI ‘3ECP_A’, file aggiuntivo 1). La saturazione del sito è stata eseguita sul sito di legame al DNA modellato della proteina. I frammenti Tn5 mutagenizzati sono stati inseriti in un vettore pET11a modificato per l’espressione in E. coli (Illumina Madison). Il vettore è kanamysin resistente per la stabilità del plasmide e ha una fusione Strep Tag II-sumo a valle del promotore T7 / operone Lac al N-terminale della regione codificante Tn5 per aiutare la purificazione. Le mutazioni driver identificate dalla regressione lineare sono state combinate dalla mutagenesi sito-diretta standard (Qiagen).
Espressione della proteina mutante e purificazione
La libreria mutante è stata placcata, singole colonie sono state selezionate per inoculare 1 L Luria Broth (LB) media con 50 μg/mL kan e sono state fatte crescere fino a OD600 = 0,5. L’espressione delle trasposasi mutanti Tn5 è stata poi indotta dall’aggiunta di 100 μM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) e l’incubazione continua a 18 ° C per 19 h.
Le cellule sono state raccolte per centrifugazione e risospese in tampone TNE1 (100 mM Tris, pH 8.0, 1 M NaCl, 1 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 1 mM ditiotreitolo (DTT)) contenente miscela completa di inibitore della proteasi (Roche). Un omogeneizzatore di vetro è stato utilizzato per rompere il pellet di cellule prima di essere passato attraverso un microfluidificatore tre volte per la lisi. Sodio deossicolato è stato aggiunto al lisato (0,1% finale) e la miscela è stata incubata a temperatura ambiente mentre agitazione per 15 min seguita da 15 min a 4 ° C. Mentre si agitava a 4 °C, è stato aggiunto alla miscela il 5% di polietilenimina, pH 7,5 (0,5% finale) e si è agitato ulteriormente per 1 ora per precipitare gli acidi nucleici che sono stati rimossi per centrifugazione (45.000 g per 20 min a 4 °C). Solfato di ammonio saturo è stato aggiunto al surnatante in un rapporto 1:1 e la miscela è stata agitata a 4 ° C per 1 h e poi centrifugato (45.000 g per 20 min a 4 ° C). Il pellet contenente le proteine mutanti Tn5 è stato risospeso in 10 mL di TNE1, centrifugato per rimuovere il particolato e il surnatante risultante è stato ulteriormente diluito 5× con TNE1 e caricato su una colonna StrepTrap High Performance (HP) (GE Healthcare) che è stato equilibrato con TNE1 utilizzando un AKTA Pure (GE Healthcare).
Dopo il carico, la colonna StrepTrap HP è stata lavata con 10 volumi di colonna (CV) di 100 mM Tris, pH 8.0, 4 M NaCl, 1 mM EDTA seguita da 10 CV 100 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA. La proteina è stata poi eluita con un gradiente di 10 CV utilizzando 100 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM Desthiobiotin (IBA-lifesciences). Le frazioni contenenti picchi a OD280 sono state raggruppate e applicate a una colonna HiTrap Heparin HP che è stata equilibrata con 100 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,2 mM EDTA (GE Healthcare). Dopo il legame, la colonna è stata lavata con 15 CV di tampone di equilibrio seguito da un gradiente salino di 20 CV (100 mM-1 M NaCl). Un singolo picco eluito a 0,5 M NaCl è stato dimostrato da sodio dodecil solfato poliacrilammide gel elettroforesi (SDS-PAGE) per contenere lo Strep-Sumo-Tn5 mutanti a 66 kDa. Il picco eluito è stato concentrato in un concentratore centrifugo Vivaspin 20 con un 10 kDa MWCO poi diluito 1:1 con glicerolo 100% per la conservazione a -20 ° C. Da questa espressione e purificazione, il rendimento delle trasposasi mutanti Tn5 è stato di circa 5 mg per 1 L di coltura.
L’assemblaggio del trasposone e la normalizzazione dell’attività
La sequenza del trasposone Tn5 mosaic end (ME) da 19 bp (contenente anche la sequenza dell’adattatore da 14 e 15 bp 5′ compatibile con il sequenziamento Illumina paired-end) è stata annealata riscaldando gli oligo a singolo filamento a 95 °C per 5 min e poi riducendo la temperatura di 5 °C ogni 2 min fino a 20 °C. Il ME annealed sono stati combinati con purificato trasposasi Tn5 ad un 1.2:1 rapporto molare (ME: trasposasi) e incubato a 37 ° C per 1 h. L’assemblaggio Transposome risultante è stato conservato a -20 ° C fino all’uso.
L’attività di tagmentazione di ogni mutante è stato normalizzato utilizzando il metodo standard e reagenti specificati nel metodo di preparazione Nextera biblioteca DNA (Illumina). In breve, 25 ng B. cereus DNA genomico (gDNA) è stato taggato da varie concentrazioni di mutanti o standard Tn5 da Illumina Nextera kit come controllo. La dimensione del DNA frammentato risultante è stata analizzata sul chip del bioanalizzatore di DNA ad alta sensibilità di Agilent. Le concentrazioni di mutanti Tn5 sono stati poi normalizzati per ottenere la stessa distribuzione delle dimensioni del frammento di DNA in cui l’area sotto la curva tra 100 e 300 bp era 20-30%, 301-600 bp 30-40%, e 601-7000 bp 30-40%, mentre l’area totale sotto la curva tra 100 e 7000 bp era ≥90% (Additional file 2: Figura S1).
Preparazione della libreria di DNA, sequenziamento e analisi dei dati
5 μL di ogni Tn5 mutante Transposome a concentrazione normalizzata è stato utilizzato per preparare librerie di sequenziamento per E. coli gDNA (genoma equilibrato), R. sphaeroides (GC genoma ricco), e B. cereus DNA genomico (AT genoma ricco) utilizzando il metodo standard Nextera preparazione libreria di DNA. Le librerie sono state poi sequenziate su MiSeq seguendo il protocollo standard di Illumina. Bias plot è stato generato contando il numero di volte che ogni nucleotide è stato osservato in ogni ciclo per tutte le letture e riportarlo come percentuale. Bias plot mostra un bias complessivo tagmentation di una trasposasi. Si noti che il bias in ogni posizione può essere indipendente dalle altre posizioni. I plot di copertura mostrano la percentuale di basi osservate a diverse profondità di sequenziamento. Sono stati generati utilizzando l’opzione mpileup di Samtools (http://www.htslib.org/). Le curve GC normalizzate e i dropout AT/GC sono stati generati utilizzando Picard Tools (http://broadinstitute.github.io/picard/).
Regressione lineare
I modelli di regressione lineare sono stati utilizzati per stimare il peso di ogni singola mutazione nell’insertion bias. Ogni modello di regressione lineare è stato applicato al contenuto del nucleotide dominante in una posizione di base nelle letture, ottenendo un modello per posizione di base. I risultati del sequenziamento di E. coli sono stati utilizzati per l’adattamento dei modelli. Quindi, i seguenti nucleotidi sono stati utilizzati come nucleotide dominante tra le posizioni di base 1 e 15: GTTTA***CTGTGCG. Poiché Tn5 agisce come un omodimero, i nucleotidi dominanti osservati nelle posizioni da 6 a 9 sono sempre basi complementari a quelle nelle posizioni da 1 a 4. Pertanto, abbiamo ignorato i modelli per le basi 6, 7 e 8 ma abbiamo mantenuto la posizione della base 9. Anche se la posizione 9 replica il comportamento della posizione 1 a causa della simmetria, la posizione 1 è influenzata da artefatti di sequenziamento quindi usiamo la posizione 9 per catturare meglio le caratteristiche della posizione 1.
Per l’addestramento è stata usata la validazione incrociata di dieci volte e i pesi sono stati mediati attraverso i 10 addestramenti incrociati. La matrice di input per le variabili predittive consisteva in righe per ogni mutante e colonne per tutte le mutazioni osservate. Le mutazioni che apparivano sempre insieme hanno causato una singolarità nella matrice. Quindi, tutte le colonne associate a queste mutazioni, tranne una, sono state eliminate. Il metodo dei minimi quadrati è stato utilizzato per risolvere i vettori di peso.
Per ogni posizione, sono state scelte le mutazioni che avevano pesi positivi o negativi significativi. Una nuova libreria di mutanti è stata creata combinando le mutazioni da posizioni diverse. Quindi, le mutazioni sono raggruppate in base all’effetto simile. I gruppi possono avere mutazioni comuni che hanno effetto su più posizioni contemporaneamente.
Tn5/DNA binding stability assay
Standard Tn5 ha dimostrato di rimanere legato al suo DNA bersaglio post tagmentazione (risultati non pubblicati). Pertanto, il riempimento del DNA taggato da parte di una polimerasi e l’ulteriore amplificazione del DNA tramite PCR saranno impediti dall’ostacolo sterico. Tuttavia, Tn5 si dissocia dal DNA etichettato a temperatura elevata, consentendo così ulteriori gap fill e PCR del DNA da una polimerasi. La temperatura richiesta per permettere la reazione PCR di una polimerasi può quindi essere usata per confrontare le stabilità di legame Tn5/DNA di vari mutanti Tn5. La temperatura più alta richiesta, il più stabile il complesso.
Il mutante Tn5-059 o Tn5 standard è stato utilizzato per taggare B. cereus gDNA in 1 mL reazione seguendo il protocollo standard Nextera tranne il buffer TD è stato sostituito da 20 mM Tris Acetato pH 7,5, 5 mM magnesio acetato. Tampone TD contiene magnesio, quindi questo non dovrebbe creare un effetto supplementare combinato con le mutazioni per cambiare il bias di inserimento. Aliquote di 25 microlitri di reazione sono stati distribuiti in una piastra PCR in triplicato e sono stati incubati a 55 ° C per 5 min seguita da centrifugazione (1000 g per 5 min a 4 ° C).
Per il secondo passo contenente PCR, una miscela PCR è stato preparato combinando 200 microlitri PPC (PCR Primer cocktail), 200 microlitri i501, 200 microlitri i507, e 400 microlitri NPM (reagenti forniti nel kit standard Nextera preparazione biblioteca DNA). 25 μL di questo mix è stato poi aggiunto a ciascuno dei 25 μL aliquota di reazione di tagmentazione sulla piastra PCR, mescolato da pipetta e restituito al termociclatore. Il gradiente di temperatura tra 72 ° C e 95 ° C è stato generato attraverso le 12 colonne della piastra e tenuto per 1 min, la piastra è stata poi incubata a 72 ° C per 5 min seguita da 98 ° C per 30 s. Dopo questo passo gap fill-denaturazione, 5 cicli di PCR specificato nel metodo di preparazione Nextera biblioteca del DNA è stato eseguito. La piastra è stata poi centrifugata a 1000 g per 5 min a 4 ° C. Ogni tagmentation-PCR reazione amplificata è stata poi purificata utilizzando una piastra Zymo Clean and Concentrator 96 pozzi ed eluito con 25 microlitri 10 mM Tris, pH 8,0. Un triplicato di campione di controllo negativo è stato preparato seguendo il protocollo di tagmentazione standard tra cui la pulizia Zymo per rimuovere Tn5 transpoase, ma senza il passo PCR. Una tripletta di controllo positivo è stata preparata seguendo il protocollo di tagmentazione standard, compresa la pulizia Zymo per rimuovere la trasposasi Tn5 e la fase di PCR per amplificare il DNA taggato. Tutti i prodotti di DNA purificato sono stati poi diluiti 1:10 in 10 mM Tris, pH 8,0 e quantificato utilizzando Picogreen e uno standard di DNA lambda.
I risultati hanno dimostrato che Tn5 standard rilascia dal DNA tagmentato e quindi permette successivo gap fill e reazioni PCR a 74,2 ° C, mentre Tn5-059 lo fa a 76,6 ° C (Additional file 3: Figura S2). La temperatura più alta richiesta per Tn5-059 ha indicato un complesso di legame al DNA più stabile.