Migliorare la solubilità della proteina ricombinante usando il tag MBP

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Espressione E. Espressione di E. coli

Generare proteine ricombinanti richiede l’uso di un ospite di espressione e E. coli è di solito la scelta migliore per questo scopo. Una combinazione di genetica semplice, facilità di coltura, espressione veloce e alti rendimenti lo rende un ospite attraente, mentre la mancanza di un efficiente macchinario post-traslazionale, la distorsione nell’uso dei codoni e la difficoltà nel produrre proteine di peso molecolare più elevato, lo rende svantaggioso. Tuttavia uno dei più grandi mali nell’espressione in E.coli è l’espressione insolubile – il fenomeno in cui la sovraespressione ricombinante porta alla formazione di aggregati proteici insolubili chiamati corpi di inclusione.

Modi per affrontare i corpi di inclusione e migliorare la solubilità della proteina bersaglio

Quando si formano corpi di inclusione, gli scienziati di solito provano un processo ingombrante chiamato solubilizzazione e ripiegamento della proteina in vitro per recuperare la proteina solubile o provano l’ottimizzazione dell’espressione a livello di processo o molecolare per evitare problemi di insolubilità. Per esempio ottimizzando le condizioni di espressione, regolando le condizioni di crescita e induzione, cambiando i media, i tamponi ecc. Un’alternativa sarebbe quella di provare un approccio molecolare e manipolare la proteina bersaglio eliminando gli elementi indesiderati all’interno della sua sequenza, creando troncamenti o mutando alcuni amminoacidi per rendere la proteina più solubile. Si potrebbe anche adottare un approccio di mutagenesi razionale, sito-diretto, basato su informazioni sulla struttura o adottare un approccio di evoluzione diretta e vagliare la solubilità di mutanti puntiformi casuali, delezioni e frammenti. Un approccio migliore e più facile sarebbe quello di adottare una strategia di partner di fusione e utilizzare un partner di fusione a monte che renda la proteina bersaglio più solubile.

Approccio di partner di fusione per migliorare la solubilità delle proteine

Con questo approccio, una proteina o un peptide difficile da esprimere viene fuso con un’altra proteina stabile e altamente solubile al fine di stabilizzare l’espressione, con l’idea che la proteina di fusione guiderà l’espressione risultante. Anche se molte proteine sono altamente solubili, non tutte sono efficaci come stimolatori di solubilità delle proteine. A questo proposito, la Maltose Binding Protein può essere un partner molto utile per la solubilità delle proteine. In uno studio comparativo orientato ad indagare le loro proprietà di miglioramento della solubilità proteica, il tag MBP dell’E. coli si è dimostrato un partner di solubilità proteica molto più efficace delle proteine Glutatione-S-transferasi (GST) e Tioredossina (TRx).

Figura 1: Raccomandazione degli scienziati GenScript riguardo al design del costrutto

Sul tag MBP e sul suo meccanismo d’azione

MBP è una proteina naturale di circa 42 kDa in E. coli, codificata dal gene malE, che è responsabile dell’assorbimento, della scomposizione e del trasporto della maltodestrina, un carboidrato. Sviluppato originariamente come tag di espressione della proteina negli anni ’80, è noto per migliorare significativamente la solubilità di una varietà di proteine target fuse a valle. Mentre l’esatto meccanismo di miglioramento della solubilità della proteina da parte del tag MBP non è chiaro, è noto che stabilizza e protegge la sua proteina passeggera a valle dalla degradazione proteolitica durante e dopo la sintesi proteica. I rendimenti citoplasmatici delle proteine fuse con MBP sono di solito più alti perché la proteina di fusione fornisce contesti affidabili per un efficiente inizio di traduzione. È stato anche proposto che il tag MBP possa agire come un chaperone tramite interazioni attraverso un punto caldo esposto al solvente sulla sua superficie che stabilizza la proteina passeggera altrimenti insolubile.

L’uso del tag MBP

Mentre il tag MBP fuso al N o al C-terminale ha dimostrato di aumentare l’espressione solubile ricombinante, un approccio comune è quello di fonderlo al N-terminale. Purtroppo, poiché nessun tag può essere ideale per tutte le applicazioni, per aumentare la versatilità di tag e applicazioni a valle, combinatorial-tagging metodi sono stati sviluppati per varie esigenze. Due tag di affinità espressi in tandem insieme a un sito di scissione della proteasi che precede la proteina bersaglio, consente l’uso di più strategie di purificazione. Incorporando un tag che aumenta la solubilità in combinazione con un tag di purificazione, si ottengono miglioramenti nella solubilità della proteina e nelle rese di espressione, nonché metodi per una purificazione efficiente

Figura 2: Uno schema generale per la strategia di progettazione dei costrutti – la combinazione di tag di affinità/solubilità all’N-terminale, il sito di scissione proteolitica seguito dalla proteina bersaglio può dare buoni risultati, soprattutto per le proteine bersaglio insolubili. Una sequenza di collegamento può spesso aiutare con i problemi di scissione proteolitica.

Purificazione delle proteine etichettate con MBP

Oltre al miglioramento della solubilità della proteina, un altro vantaggio di usare una strategia di fusione con MBP è quello di facilitare la purificazione della proteina bersaglio a valle. MBP è un tag di affinità naturale che si lega alla resina di amilosio e può essere utilizzato per la purificazione di affinità a passo singolo legandosi all’amilosio reticolato. Le proteine ricombinanti con tag MBP legate all’amilosio immobilizzato sono tipicamente eluite in condizioni non denaturanti utilizzando maltosio.

Svantaggi di questa strategia

• La scissione della proteina bersaglio può essere un problema a causa dell’ostacolo sterico del tag MBP
• La resina di amilosio può essere fragile e relativamente costosa
• La precipitazione della proteina bersaglio dopo la scissione
• Alcune proteine di fusione MBP non si legano in modo efficiente alla resina di amilosio e anche quando lo fanno, i rendimenti possono essere un problema

Conclusione

Mentre non esiste una soluzione semplice e globale per affrontare i problemi di insolubilità nell’espressione in E.coli, un costrutto ben progettato e una strategia di espressione accuratamente elaborata possono darvi la proteina solubile desiderata. MBP è un tag di solubilità affidabile per la produzione di proteine solubili ricombinanti e mentre la solubilità è uno degli elementi più importanti di una campagna di produzione di proteine, l’obiettivo finale non dovrebbe essere sempre la solubilità. I livelli di espressione, l’attività della proteina, la purezza, l’omogeneità e la stabilità sono tutti fattori importanti che devono anche essere presi in considerazione prima di intraprendere una campagna di produzione di proteine ricombinanti.

Poche pubblicazioni che dimostrano l’utilità del tag MBP

La produzione di fusocine utilizzando la fusione della proteina MBP-maltosio-Binding Protein Fusion Allows for High Level Bacterial Expression and Purification of Bioactive Mammalian Cytokine Derivatives (September 2014)

The rescue of aggregation-prone proteins using MBP -Rescuing aggregation-prone proteins in Escherichia coli with a dual His₆-MBP tag (May 2014)

MBP for soluble protein production in E. coli -Hexahistidine-tagged maltose-binding protein as a fusion partner for the production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli (2009)

1. Pryor, K. A., e Leiting, B. (1997). Espressione ad alto livello di proteine solubili in Escherichia coli usando un sistema di fusione per doppia affinità con His6-tag e proteina legante il maltosio. Protein Expr. Purif. 10, 309-319
2. Routzahn, K. M. e Waugh, D. S. (2002). Effetti differenziali dei tag di affinità supplementari sulla solubilità delle proteine di fusione MBP. J. Struct. Funct. Genomics 2, 83-92
3. Nallamsetty, S., Austin, B. P., Penrose, K., J., and Waugh, D. S. (2005) Gateway vectors for the production of combinatorially tagged His6-MBP fusion proteins in the cytoplasm and periplasm of Escherichia coli. Protein Sci. 14, 2964-2971
4. Esposito D, Chatterjee DK: Miglioramento dell’espressione della proteina solubile attraverso l’uso di tag di fusione. Curr Opin Biotechnol 2006, 17:353-8.184.
5. Peti W, Page R: Strategie per massimizzare l’espressione di proteine eterologhe in Escherichia coli con costi minimi. Protein Expr Purif 2007, 51:1-10.]
6. Wilkes D.M., Espressione e purificazione del primo dominio di legame al nucleotide e della regione di collegamento del prodotto genico umano di resistenza ai farmaci: confronto tra fusioni a glutatione S-transferasi, tioredossina e proteina legante il maltosio. Biochemical Journal 1999, 77-81
7. Fox JD, Kapust RB, Waugh DS: Singole sostituzioni di aminoacidi sulla superficie della maltose-binding protein di Escherichia coli possono avere un profondo impatto sulla solubilità delle proteine di fusione. Protein Sci 2001, 10:622-630

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