L’antigene HRP2 è noto per persistere in circolazione dopo il trattamento curativo e questo ha portato a suggerire che gli RDT che rilevano HRP2 hanno una specificità ridotta per rilevare l’infezione malarica attiva nelle aree a trasmissione moderata o elevata. D’altra parte, il pLDH viene metabolizzato più rapidamente e, quindi, ci si aspetta che gli RDT che rilevano questo enzima tornino a essere negativi più rapidamente dopo il trattamento della malaria. Pertanto, una strategia allettante per differenziare le infezioni passate e trattate da quelle attuali è quella di utilizzare RDT combinati che rilevano HRP2 e pf, o RDT che contengono bande di test HRP2 e Pf-pLDH separate. Mentre questo approccio sembra inizialmente ragionevole in circostanze in cui si è verificata un’infezione recente, la sua applicazione generale alla gestione clinica dei casi di febbre è oggetto di discussione. Hawkes et al. concludono che richiedere la positività di entrambe le bande HRP2 e pLDH in una RDT combinata può migliorare la specificità diagnostica per la malaria falciparum in un contesto africano sub-sahariano, escludendo risultati HRP2 falsi positivi dovuti ad antigeniemia persistente. Questa conclusione è stata raggiunta dopo aver confrontato i risultati del RDT con la microscopia in un campione di bambini sotto i cinque anni di età ricoverati per malattia febbrile. Mentre questo suggerimento può essere appropriato per la selezione degli individui per gli studi clinici, l’estensione di questo alla diagnosi clinica o alla gestione è discutibile poiché questa conclusione si basa sul presupposto che tutti gli RDT che sono HRP2-positivi ma pLDH-negativi rappresentano un’antigeniemia persistente. Alla base di questa ipotesi c’è la premessa che tutte le infezioni in corso producano risultati positivi su entrambe le bande HRP2 e pLDH dei RDT, un’affermazione che non è stata testata in precedenza in modo sistematico per più prodotti RDT.
Per affrontare questa lacuna, questo studio ha analizzato i dati generati durante il programma di test dei prodotti WHO-FIND per i RDT per la malaria con un’attenzione specifica alla reattività delle singole bande di test in 18 RDT per la malaria combinati che soddisfano gli attuali criteri di acquisto raccomandati dall’OMS. Diciassette di questi prodotti usavano PfHPR2 per il rilevamento di P. falciparum. Durante il test dei prodotti WHO-FIND, questi 18 prodotti sono stati in grado di rilevare in modo coerente >75% dei campioni di P. falciparum e P. vivax wildtype ad una diluizione di 200 parassiti/μL con bassi tassi di falsi positivi o identificazione errata delle specie. Anche se questo studio si è concentrato sul rilevamento di P. falciparum, i RDT selezionati per l’inclusione in questa analisi sono stati volutamente limitati a quelli che soddisfano i criteri per il rilevamento sia di P. falciparum che di P. vivax per essere certi che le bande del pan test avessero buone prestazioni quando interpretate secondo le istruzioni del produttore. Questo elimina la possibilità che i risultati osservati in questo studio fossero causati da una pan band disfunzionale.
I risultati dell’analisi attuale indicano che c’è una differenza nella sensibilità delle bande del test HRP2-detecting e delle bande del test pan-pLDH nel rilevamento dell’infezione attiva. A basse densità di parassiti è stato osservato che la banda HRP2-detecting ha dato un risultato positivo in assenza di una banda pan positiva in oltre il 40% dei test positivi, e questa percentuale è specifica per il prodotto. Questa tendenza era meno evidente a densità di parassiti più elevate, dove entrambe le bande tendevano ad essere positive contemporaneamente. Questo risultato corrisponde a quello precedentemente riportato per il prodotto SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan (numero di catalogo 05FK60, Standard Diagnostics Inc., Corea del Sud) dove la percentuale di test positivi su entrambe le bande HPRP2 e pLDH aumentava progressivamente con la densità del parassita dal 6,7% a <100 parassiti/μL al 98,5% a >1000 parassiti/μL . Modelli simili sono stati riportati anche per il prodotto SD Malaria Antigen P.f (numero di catalogo 05FK90, Standard Diagnostics Inc. Corea del Sud).
L’analisi ha anche rivelato che anche quando entrambe le bande pan e P. falciparum erano positive, l’intensità della banda pan era generalmente inferiore alla banda Pf, indipendentemente dalla densità del parassita. Alla più bassa densità di parassiti di 200 parassiti/μL, il 65% delle bande di pan positive aveva un’intensità di 1. Questa proporzione si riduce al 16% quando i campioni contengono 2.000 o 5.000 parassiti/μL. Quindi, anche quando la pan band è positiva, è spesso debole. Il test RDT condotto per il programma di test del prodotto WHO-FIND avviene al CDC in condizioni ideali che aiutano l’identificazione di questi deboli risultati positivi. Tuttavia, le bande deboli sono spesso difficili da vedere e possono essere mancate dagli operatori sanitari che lavorano in condizioni di scarsa illuminazione o con acuità visiva ridotta. Questo gonfierebbe la proporzione di RDT che hanno una banda HRP2 positiva e una banda pan negativa.
Ci sono diverse possibili ragioni per le differenze osservate nella positività e nell’intensità delle bande HRP2 Pf rispetto alle bande pLDH pan. In primo luogo, l’abbondanza relativa di HRP2 e pLDH può differire all’interno dei parassiti. I campioni utilizzati nell’ambito dello studio attuale avevano intervalli di concentrazione ampi ma simili per HRP2 e pLDH e c’era una significativa correlazione positiva tra le concentrazioni dei due antigeni. Quindi non sembra che differenze grossolane nella concentrazione dell’antigene siano state la causa della disparità nelle prestazioni della banda di test contro P. falciparum.
La seconda possibile ragione è legata alle differenze di avidità dell’antigene per il legame degli anticorpi legati alle linee di test RDT. I risultati attuali indicano che sono necessari circa 4 ng/mL di HRP2 per ottenere una banda HRP2 positiva in oltre il 95% dei test, rispetto a oltre 45 ng/mL per il pan-pLDH. Questa differenza di concentrazione si allinea con l’antigene HRP2 che ha epitopi di legame multipli a causa della sua struttura ripetuta, rispetto al pLDH, che è un singolo epitopo. Lee et al. hanno riportato che i motivi HPR2 più frequenti si sono verificati all’interno della sequenza HRP2 con una frequenza di 8-25, a seconda del motivo e della sequenza specifica. Questa frequenza si allinea approssimativamente con le differenze di concentrazione di soglia osservate qui. Quindi, sembra che la differenza nell’avidità di legame degli anticorpi tra HRP2 e pLDH possa essere una causa delle differenze di sensibilità delle rispettive bande di test. È improbabile che l’ordine delle bande sulla striscia spieghi la diminuzione delle prestazioni delle bande del pan test, perché per tutti i test tranne due inclusi in questa analisi la banda del pan test è la più lontana dall’origine e questa posizione è vantaggiosa perché la velocità del flusso con cui l’analita passa la linea del reagente di cattura è più lenta; e la concentrazione effettiva dell’analita nel campione è più alta.
Sono stati condotti molti studi per valutare le prestazioni dei RDT specifici per la malaria in diverse situazioni. Tuttavia pochi hanno confrontato direttamente i RDT che rilevano HRP2 con quelli che rilevano pLDH, ed esaminato le potenziali ragioni delle differenze tra i due tipi di test. Uno studio longitudinale in Uganda ha identificato che i RDT che rilevano HRP2 forniscono una migliore rilevazione dei parassiti a basse densità rispetto ai RDT che rilevano pLDH, ma hanno una specificità inferiore a causa della più lenta eliminazione dell’antigeneemia HRP2 dalla circolazione sanguigna. Sono state anche osservate differenze nelle prestazioni tra regioni con diverse intensità di trasmissione, e questa differenza è stata attribuita alla superiore capacità dei RDT che rilevano HRP2 rispetto ai RDT che rilevano pLDH di rilevare la parassitemia sub-patente. Questi risultati, sebbene ottenuti confrontando diversi RDT che rilevano entrambi P. falciparum, appaiono rilevanti per i test di combinazione con anticorpi contro questi due antigeni. Sarebbe possibile distinguere tra l’antigene HRP2 persistente e la parassitemia falciparum vitale in un dato campione di sangue confrontando i risultati di un RDT basato su HRP2 con un RDT separato, altrettanto performante, contenente una banda pLDH falciparum, ma questa non è una proposta fattibile per l’uso sul campo.
Quindi, rimane il problema di come gestire clinicamente un paziente febbrile con una storia di recente trattamento antimalarico che restituisce una banda HRP2 positiva, ma una banda pLDH negativa su una combinazione RDT. Questo può derivare da un’antigeniemia persistente o da una reinfezione o recrudescenza della malaria (fallimento del trattamento). Il fallimento del trattamento può derivare dalla resistenza al farmaco o da un’esposizione inadeguata al farmaco a causa di un dosaggio sub-ottimale, scarsa aderenza, vomito, farmacocinetica insolita in un individuo o farmaci di scarsa qualità. È importante determinare dall’anamnesi del paziente se ha vomitato il trattamento precedente o non ha completato l’intero ciclo di trattamento. Questi casi devono essere trattati di nuovo con la terapia combinata artemisina-combinazione (ACT) raccomandata come prima linea nella zona.
Se l’anamnesi del paziente rivela che ha preso il corso di trattamento completo e correttamente dosato, la possibilità di un vero fallimento del trattamento può essere esclusa solo riferendo il paziente a una struttura con una microscopia di buona qualità. Il rinvio può essere comunque necessario per ottenere un trattamento di seconda linea. Nei singoli pazienti può non essere possibile distinguere la recrudescenza dalla reinfezione, anche se la mancanza di risoluzione della febbre e della parassitemia (al microscopio) o la loro ricorrenza entro quattro settimane dal trattamento sono considerati fallimenti del trattamento con l’ACT attualmente raccomandato. Per questi casi il trattamento di seconda linea raccomandato è un ACT alternativo noto per essere efficace nella regione. Oltre alle indicazioni di cui sopra, in tutti i casi l’operatore sanitario dovrebbe sempre prendere in considerazione altre diagnosi e seguire da vicino la risposta clinica.
La ricomparsa della febbre e della parassitemia più di quattro settimane dopo il trattamento può essere dovuta ad una recrudescenza o ad una nuova infezione. La distinzione può essere fatta solo attraverso la genotipizzazione dei parassiti dell’infezione iniziale e di quella ricorrente. Poiché la genotipizzazione dei parassiti non è usata di routine nella gestione dei pazienti, allora tutti i presunti fallimenti del trattamento dopo quattro settimane di trattamento iniziale dovrebbero essere considerati nuove infezioni ed essere trattati con l’ACT di prima linea.
In definitiva, i risultati di questo studio mostrano chiaramente che nel contesto di un’infezione malarica attiva (non trattata), è comune che i test combinati HRP2/pan-pLDH restituiscano una banda HRP2 positiva combinata con una banda pan-pLDH negativa a basse densità di parassiti, e quando entrambe le bande sono positive, spesso la banda pan è debole anche a densità di 2.000 parassiti/μL. Pertanto sarebbe pericoloso interpretare la presenza di una banda HRP2 in assenza di una banda pan come causata esclusivamente da un’antigeniemia persistente in un contesto clinico. Solo quando la sensibilità della banda pLDH-detecting pan sarà migliorata per avere la stessa reattività della banda HRP2 per il rilevamento di P. falciparum, l’antigeniemia persistente potrebbe essere attribuita con fiducia come causa dei risultati RDT HRP2-positivi e pan-negativi.