L’interesse di Ochoa per la biologia fu stimolato dal lavoro del premio Nobel spagnolo Santiago Ramón y Cajal, che studiò la struttura del sistema nervoso. Ochoa frequentò la scuola di medicina dell’Università di Madrid nel 1923, sperando di lavorare con il dottor Cajal, ma quest’ultimo si era ormai ritirato. Anche se la stessa scuola di medicina non ospitava strutture di ricerca, Ochoa fu in grado di espandere il suo potenziale accademico e scientifico. Essendo un ottimo studente, Ochoa e il suo talento furono rapidamente notati dal professore di fisiologia dell’università, il dottor Juan Negrín, che selezionava regolarmente studenti brillanti come suoi assistenti di laboratorio. A Ochoa fu dato inizialmente il compito piuttosto di routine di isolare la creatinina dall’urina. Sviluppò anche un metodo per misurare la creatinina muscolare. Durante l’estate del 1927, quando Ochoa era ancora uno studente di medicina al quarto anno, si recò a Glasgow, in Scozia, per lavorare con il dottor Noel Paton per migliorare il dosaggio della creatinina e la sua conoscenza dell’inglese. In breve tempo, fu in grado di pubblicare la sua prima nota scientifica nei Proceedings of the Royal Society, e al suo ritorno a Madrid, lui e il suo compagno di studi José Valdecasas presentarono un articolo al prestigioso Journal of Biological Chemistry. Fu un momento di orgoglio per lui, data la sua giovane età e il fatto che l’inglese non era la sua lingua madre, e si dice che ricordasse spesso questo risultato.
Durante la scuola di medicina, Ochoa visse nella nota Residencia de Estudiantes di Madrid in mezzo a molte aspiranti meraviglie artistiche e scientifiche, tra cui il pittore Salvador Dali e il poeta Federico García Lorca. Durante il periodo in cui Ochoa visse lì ci furono frequenti conferenze di premi Nobel come Marie Curie e Albert Einstein. Dopo aver ottenuto la sua laurea in medicina con lode nel 1929, Ochoa, all’età di 24 anni, fece domanda per una borsa di studio presso il laboratorio di Otto Meyerhof a Berlino, in Germania, che era all’avanguardia della nuova disciplina della biochimica. Lì, ha interagito con molti biochimici famosi come il dottor Otto Warburg e il dottor Fritz Lipmann. Meyerhof, famoso per la sua via Embden-Meyerhof nella glicolisi, con cui il glucosio viene convertito in acido piruvico con produzione di adenosina trifosfato (ATP), aveva vinto lui stesso il premio Nobel meno di un decennio prima. Quello stesso anno, Ochoa fece un viaggio a Boston per partecipare al Congresso Internazionale di Fisiologia e visitò diversi luoghi degli Stati Uniti (USA), dove viveva uno dei suoi fratelli. Al suo ritorno in Spagna nel 1930, riprese il lavoro alla Residencia de Estudiantes per completare la ricerca per la sua tesi di laurea in medicina.
Nel 1931, Ochoa si innamorò due volte. Il primo fu di una donna di nome Carmen García Covián, che sposò. Il secondo fu per l’enzimologia, che scoprì mentre lavorava come post-dottorato con il dottor H W Dudley nel laboratorio di Sir Henry Dale in Inghilterra, un altro premio Nobel, per le sue ricerche sull’acetilcolina. Partendo dal suo precedente lavoro sulla creatinina muscolare, Ochoa si avventurò nel mondo degli enzimi e del loro ruolo nel metabolismo intermedio. Fu un punto di svolta nella sua carriera e divenne il suo interesse per tutta la vita. La sua prima introduzione fu un enzima chiamato gliossalasi, la cui funzione primaria è quella di disintossicare sostanze come il metilgliossale e altre aldeidi. Questi composti sono sottoprodotti dei normali processi biochimici viventi, ma altamente tossici per le cellule. Il notevole enzima che ha catturato l’attenzione di Ochoa nel 1931 sarebbe stato preso di mira dalle aziende farmaceutiche decenni dopo per creare antibiotici e farmaci anticancro. Ma per Ochoa, la gliossalasi era un trampolino di lancio per le prolifiche scoperte biochimiche che presto seguirono, in particolare il suo lavoro sugli acidi nucleici e l’RNA.