Prove per la teoria dei radicali liberi/stress ossidativo dell’invecchiamento dal consorzio CHANCES: a meta-analysis of individual participant data

Popolazione studiata

Questa indagine si basa sulle coorti HAPIEE (Health, Alcohol and Psychosocial factors in Eastern Europe) di Polonia, Repubblica Ceca e Lituania, e sul follow-up di 8 anni della coorte tedesca ESTHER (nome tedesco: “Epidemiologische Studie zu Chancen der Verhütung, Früherkennung und optimierten Therapie chronischer Erkrankungen in der älteren Bevölkerung”) .

L’intero studio HAPIEE comprende coorti in quattro paesi. Poiché non è stato possibile esportare campioni di sangue dalla Russia, solo tre coorti sono state incluse nell’analisi attuale. I partecipanti allo studio sono stati reclutati in sei città ceche (Havirov/Karvina, Hradec Kralove, Jihlava, Kromeriz, Liberec e Usti nad Labem) nel 2002-2005 (n = 8.857), a Cracovia, Polonia, nel 2002-2005 (n = 10.728), e a Kaunas, Lituania, nel 2006-2008 (n = 7.161). Ogni coorte consiste in un campione casuale di uomini e donne, di età compresa tra 45 e 75 anni al basale, stratificato per sesso e gruppi di età di 5 anni, selezionato dai registri della popolazione. Il tasso di risposta complessivo è stato del 61%. I dati sono stati raccolti tramite un questionario e un breve esame in una clinica durante il quale è stato prelevato un campione di sangue venoso a digiuno.

Lo studio ESTHER è una coorte basata sulla popolazione di 9.949 adulti, di età compresa tra 50 e 74 anni al basale, reclutati dai loro medici generici (GP) durante un controllo sanitario di routine tra il 2000 e il 2002 nello stato federale tedesco Saarland. L’attuale indagine si basa sul follow-up di 8 anni, condotto tra luglio 2008 e dicembre 2010, in cui i partecipanti allo studio avevano un’età compresa tra 56 e 85 anni. Dal basale al follow-up di 8 anni, 499 individui erano deceduti, 505 individui non erano più in grado di partecipare a causa di cattiva salute, e 680 avevano rifiutato un’ulteriore partecipazione. Dei rimanenti 8.265 partecipanti, 6.061 hanno rinviato un questionario (tasso di risposta, 73,4%) e 4.637 hanno donato un campione di sangue nell’ufficio del loro medico di base. I medici di base dei partecipanti allo studio hanno anche completato un questionario sullo stato di salute dei partecipanti allo studio (disponibile per n = 5.997). Inoltre, 3.124 partecipanti allo studio hanno acconsentito a un’ulteriore valutazione geriatrica di 3 ore eseguita dai medici dello studio a casa dei partecipanti.

Le variabili degli studi ESTHER e HAPIEE sono state armonizzate e i marcatori di stress ossidativo sono stati misurati nel quadro del Consortium on Health and Ageing: Network of Cohorts in Europe and the United States (CHANCES; www.chancesfp7.eu), che è stato descritto altrove. Gli studi sono stati condotti in conformità con la dichiarazione di Helsinki e il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti allo studio.

Etica, consenso e autorizzazioni

Gli studi inclusi sono stati approvati dai rispettivi comitati etici locali (ESTHER: Facoltà di Medicina dell’Università di Heidelberg e l’Associazione Medica del Saarland; HAPIEE: University College London (Gran Bretagna), Istituto Nazionale di Sanità Pubblica (Praga, Repubblica Ceca), Università Jagellonica (Cracovia, Polonia), e Università Lituana di Scienze della Salute (Kaunas, Lituania)). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti inclusi negli studi analizzati e gli studi sono stati condotti in conformità con la Dichiarazione di Helsinki.

Valutazione delle variabili

Negli studi ESTHER e HAPIEE, i dati sociodemografici, lo stile di vita e la storia della malattia sono stati valutati mediante questionari autosomministrati. Altezza e peso sono stati misurati e integrati da informazioni auto-riferite in ESTHER per quei partecipanti allo studio che non hanno acconsentito alla visita a domicilio. Oltre alle informazioni auto-riferite, la storia delle malattie croniche comuni è stata convalidata nello studio ESTHER consultando le cartelle cliniche o il registro dei tumori del Saarland. L’insufficienza renale è stata definita da una velocità di filtrazione glomerulare stimata <60 mL/min/1,73 m2, calcolata con l’equazione Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration basata sulla creatinina. Nella coorte ESTHER, le concentrazioni di creatinina nel siero sono state valutate con un metodo cinetico Jaffé su un Cobas 8000 C701 (analita: CREJ2 3000, Roche). Il colesterolo totale e il colesterolo delle lipoproteine ad alta densità (HDL) sono stati valutati in campioni di siero mediante cromatografia enzimatica (analiti: Chol2 2100, HDLC3 450, Roche) e la proteina C reattiva (CRP) mediante immunoturbidimetria sul Cobas 8000 C701 (analita: CRPL3 500, Roche). In HAPIEE, anche il colesterolo totale e HDL sono stati valutati con la stessa metodologia di dosaggio e gli analiti Roche, ma sono stati utilizzati diversi autoanalizzatori (HAPIEE Repubblica Ceca e Lituania: Roche Cobas Mira; HAPIEE Polonia: Hitachi 917/Modular P). Inoltre, in tutte le coorti HAPIEE, la creatinina sierica e la CRP sono state valutate con la stessa metodologia di dosaggio di ESTHER, ma con analiti di un fornitore diverso (Beckman-Coulter) e su un diverso autoanalizzatore (LX-20 Pro, Beckman-Coulter).

Accertamento della mortalità

Per queste analisi, abbiamo utilizzato il follow-up della mortalità totale dai registri ufficiali di mortalità nazionali (Repubblica Ceca, Germania), locali (Lituania) o regionali (Polonia) fino al 31 dicembre 2010 in Polonia, al 31 dicembre 2011 in Repubblica Ceca e Lituania e fino al 31 luglio 2014 in Germania. La mortalità specifica per causa in Germania era disponibile solo per i decessi avvenuti fino al 2 aprile 2013. I registri erano completi per tutti i partecipanti che non si sono spostati al di fuori della regione coperta dal registro. La perdita al follow-up dovuta alla migrazione è stata del 4 % nelle coorti HAPIEE (combinate) e del 2 % nello studio ESTHER. Tutte le morti codificate con i codici ICD-10 I00-I99 sono state considerate morti cardiovascolari e le morti per cancro sono state definite dai codici ICD-10 C00-C97.

Misurazione dei marker sierici dello stress ossidativo

I test utilizzati per misurare i livelli di d-ROMs (Diacron, Grosseto, Italia) e TTL (Rel Assay Diagnostics, Gaziantep, Turchia) sono stati adattati a un autoanalizzatore (LX20-Pro, Beckman-Coulter, Woerden, Paesi Bassi) presso il Laboratory for Health Protection Research (Bilthoven, Paesi Bassi), come descritto precedentemente. Il test d-ROMs misura la concentrazione di idroperossido in unità Carratelli (Carr U), dal nome dell’inventore del test, Mauro Carratelli. Ogni Carr U corrisponde a 0,08 mg di perossido di idrogeno (H2O2)/100 mL nel campione. Il test TTL misura la concentrazione di gruppi tiolici liberi nel campione in μmol/L.

Le misurazioni sono state effettuate in campioni di siero che erano stati conservati per circa 3-10 anni in congelatori a -80 °C. d-ROMs e TTL hanno una buona stabilità a lungo termine in queste condizioni. Nel follow-up di 8 anni di ESTHER, d-ROMs e TTL sono stati misurati in tutti i partecipanti che hanno donato campioni di sangue nei loro studi medici (n = 4.637). Tuttavia, le misurazioni sono state condotte in due diversi punti temporali perché il finanziamento non era disponibile per misurare tutti i campioni nello studio pilota condotto nel giugno 2012. Per correggere i potenziali spostamenti nei saggi, 80 campioni del time-point 1 (giugno 2012) sono stati misurati nuovamente al time-point 2 (settembre 2014) e sono state ottenute equazioni di regressione lineare che sono state utilizzate per standardizzare i risultati del time-point 2 ai livelli del time-point 1, quando hanno avuto luogo anche le misurazioni nelle coorti HAPIEE (per tutto il 2012). L’accordo delle misurazioni d-ROMs era alto (coefficiente di correlazione Spearman r = 0,92 e differenza di mezzi = 15 Carr U) e quindi non sono state applicate correzioni. Per TTL, uno spostamento evidente nei risultati del test (r = 0,88 e differenza di mezzi = 81 μmol/L) è stato corretto applicando la seguente equazione a tutte le misurazioni del punto temporale 2: TTLtime-point2 = 0,746 × TTLtime-point1. Inoltre, abbiamo escluso 610 misurazioni in campioni di sangue che non soddisfacevano rigorosi criteri di qualità emolitica, itterica e lipemica nello studio ESTHER, lasciando 4.027 per l’analisi nel presente studio. Nelle coorti HAPIEE, il numero di campioni che non soddisfacevano questi criteri di qualità era trascurabile.

Campione dello studio analitico

A causa dei finanziamenti limitati, i livelli di d-ROMs e TTL non sono stati misurati in tutti i partecipanti delle coorti HAPIEE; invece, è stato adottato un disegno di controllo dei casi abbinati (file aggiuntivo 1: Figura S1). I casi sono stati definiti come tutti i soggetti che sono morti durante il follow-up (n = 1.433) o sperimentato incidente non fatale infarto del miocardio (MI) o ictus (n = 658). I controlli (n = 4.396) sono stati abbinati ai casi per sesso e gruppi di età di 5 anni. Per correggere il sovracampionamento per MI e ictus in questa analisi di mortalità, i soggetti con MI non fatale o ictus non fatale durante il follow-up sono stati esclusi dai casi in una prima fase. Al fine di aggiungere un campione rappresentativo di soggetti con eventi non fatali di MI o ictus ai controlli, in una seconda fase, è stata calcolata la proporzione osservata di eventi non fatali di MI o ictus in ogni strato specifico per età e sesso nella coorte totale. In una terza fase, queste proporzioni sono state moltiplicate per le dimensioni del campione in ogni strato nei controlli con marcatori di stress ossidativo misurati. In una quarta fase, i numeri risultanti sono stati selezionati a caso in ogni strato dal gruppo di soggetti con incidenti non fatali MI o ictus e aggiunti ai controlli, ottenendo un pool di 4.552 controlli ammissibili per i 1.433 morti. Nella fase finale, il pool di controlli idonei è stato utilizzato per abbinare individualmente esattamente due controlli ad ogni morte per coorte, sesso ed età (±5 anni).

Analisi statistiche

Le differenze nelle caratteristiche di base tra casi (morte durante il follow-up) e controlli sono state valutate con il test χ2 per le variabili categoriche e il test di Wilcoxon rank-sum per le variabili continue. Le associazioni trasversali dei fattori di rischio stabiliti per la mortalità con alti livelli di stress ossidativo sono state valutate con modelli di regressione logistica che comprendono tutte le caratteristiche di base modellate come variabili categoriche (Tabella 1). La variabile dipendente “alto stress ossidativo” è stata definita da due diverse definizioni basate sui livelli d-ROMs o TTL. Per i d-ROMs, secondo le istruzioni del produttore, è stato impiegato un cut-off clinico di >400 Carr U, che ha classificato il 23% della coorte ESTHER e il 30% dei controlli idonei della coorte HAPIEE nella categoria “alto” stress ossidativo. Per il TTL, non sono disponibili cut-off clinici e, poiché il test non è ancora standardizzato, le medie della popolazione variavano fortemente tra le coorti. Pertanto, per far corrispondere la proporzione di individui con elevato stress ossidativo ottenuta dalla definizione basata sui livelli d-ROMs, è stato utilizzato il quartile TTL inferiore specifico della coorte (25%) per classificare i soggetti in una categoria di stress ossidativo elevato basata sul TTL. Le analisi trasversali sono state condotte in tutti i soggetti e separatamente per donne e uomini.

Tabella 1 Caratteristiche basali dei partecipanti allo studio per coorte e stato dei casi (morte durante il follow-up) e numero di casi per analisi di mortalità specifica per coorte

Per analisi longitudinali, La regressione proporzionale di rischio di Cox (coorte ESTHER) e la regressione logistica condizionale (studio caso-controllo abbinato HAPIEE) sono state utilizzate per stimare gli hazard ratio e gli odds ratio, rispettivamente, per un aumento dei livelli d-ROMs e una diminuzione del TTL di una deviazione standard (SD) specifica della coorte. Inoltre, i livelli d-ROMs sono stati modellati come una variabile categorica, con cut-off clinici raccomandati dal produttore per lo stress ossidativo moderato (341-400 Carr U), alto (401-500 Carr U) e molto alto (>500 Carr U) con riferimento ai soggetti con stress ossidativo non aumentato o basso (≤340 Carr U). Quando il rischio assoluto è basso, la regressione logistica e la regressione di Cox di solito producono risultati simili e l’odds ratio può essere considerato un’approssimazione del più accurato hazard ratio. Abbiamo usato il termine rischio relativo (RR) per entrambe le stime degli effetti. Nell’analisi di sensibilità, le analisi sulla mortalità causa-specifica nella coorte ESTHER sono state effettuate considerando il rischio concorrente di morte per altre cause, adattando un modello di regressione proporzionale di subdistribuzione delle probabilità con pesi per i soggetti che hanno subito l’evento di rischio concorrente secondo un’estensione del metodo Fine e Gray . Tuttavia, i risultati sono stati quasi identici con la tradizionale regressione proporzionale di Cox e quindi solo questi ultimi risultati sono mostrati in questo manoscritto.

Le analisi sono state condotte separatamente per ogni coorte e raggruppate mediante meta-analisi con ponderazione Mantel-Haenszel ed effetti casuali, tenendo conto della dimensione del campione delle coorti e la possibilità di eterogeneità statistica tra gli studi. Quest’ultima è stata esaminata con il test Q di Cochrane e la statistica I2.

Sono stati analizzati i seguenti risultati: mortalità per tutte le cause, CVD, cancro e non-CVD, cause non-cancro. Per ogni risultato, sono stati sviluppati quattro modelli statistici, con una crescente inclusione di fattori di rischio di mortalità stabiliti nei modelli. Sia i livelli d-ROMs che il TTL sono stati sempre inclusi nello stesso modello perché la loro correlazione era bassa (r <0,08 in ogni coorte). Nel modello 1, l’aggiustamento è stato fatto per l’età e il sesso nella coorte ESTHER, mentre questo non è stato necessario per le coorti HAPIEE perché i casi sono stati abbinati individualmente a due controlli per età e sesso e analizzati in analisi stratificata in cui gli strati consistono nella raccolta di set abbinati. Il modello 2 ha inoltre aggiustato per l’istruzione, l’indice di massa corporea (BMI), il fumo, il consumo di alcol e l’attività fisica. Il modello 3 ha incluso anche le malattie che potrebbero potenzialmente mediare l’associazione dello stress ossidativo con la mortalità (cioè dislipidemia (valutata dal colesterolo totale e HDL), insufficienza renale, una storia di diabete, ipertensione, MI, ictus e cancro). Infine, il modello 4 è stato ulteriormente aggiustato per i livelli di CRP, che erano fortemente correlati con i livelli di d-ROMs (r = 0,34-0,41 nelle coorti) e, meno fortemente, con TTL (r = 0,11-0,17 nelle coorti). L’età è stata modellata come variabile continua e tutte le altre variabili sono state modellate come variabili categoriche (le categorie sono riportate nella tabella 1). Abbiamo testato le interazioni tra d-ROMs/TTL con le covariate aggiungendo termini di interazione appropriati al modello 2.

I sottogruppi da analizzare sono stati scelti a priori con lo scopo di stratificare per i più importanti determinanti potenziali di alti livelli di stress ossidativo: coorte/paese, età, sesso, storia di MI o cancro e stato infiammatorio. A causa delle limitazioni delle dimensioni del campione, le analisi stratificate sono state limitate alla mortalità per tutte le cause, CVD e cancro. Per affrontare la possibilità di bias di causalità inversa, le analisi sono state condotte separatamente per gli eventi che si sono verificati negli anni 1-2, anni 3-4, e anni 5-6 di follow-up. A causa delle limitazioni delle dimensioni del campione, questa analisi stratificata ha potuto essere eseguita solo per la mortalità per tutte le cause. Per evitare l’instabilità del modello, un risultato dell’analisi del sottogruppo specifico della coorte è stato considerato per la meta-analisi solo quando si sono verificati almeno 25 eventi nel sottogruppo.

L’imputazione multipla è stata impiegata per imputare il numero di valori di covariate mancanti al basale mostrati nel file aggiuntivo 1: Tabella S1. La percentuale di valori mancanti era inferiore al 5% per tutte le variabili, ad eccezione del consumo di alcol e dell’attività fisica, che avevano fino al 22% di valori mancanti. Al meglio delle nostre conoscenze, i dati erano mancanti a caso, che è il presupposto dell’imputazione multipla. Separatamente per coorte, stato dei casi e sesso, 20 set di dati completi sono stati imputati con la procedura SAS 9.3 “PROC MI”, utilizzando il metodo Markov chain Monte Carlo. Le variabili del modello “completo” sono state utilizzate per il modello di imputazione. Tutte le analisi multivariabili sono state eseguite nei 20 set di dati imputati e i risultati dei singoli set di dati sono stati combinati dalla procedura SAS 9.3 “PROC MIANALYZE”.

Le meta-analisi sono state condotte con il software statistico Comprehensive Meta-Analysis 2.0 (Biostat, Englewood, NJ, USA). Tutte le altre analisi sono state condotte con SAS, versione 9.2 (Cary, North Carolina, USA). Tutti i test statistici erano a due lati, utilizzando un livello alfa di 0,05.

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