Purificazione del DNA a singolo filamento mediante co-polimerizzazione con acrilammide ed elettroforesi

Il DNA a singolo filamento (ssDNA) è utile per aptamers (1), auto-assemblaggio (2), origami di DNA (3), circuiti di DNA (4), sonde di ibridazione (5), e robotica del DNA (6). Il DNA sintetizzato chimicamente è a singolo filamento per default.

Qui, presentiamo un metodo per produrre ssDNA da un prodotto di PCR. L’uso di un prodotto di PCR invece di DNA sintetico può essere vantaggioso poiché la PCR introduce meno mutazioni rispetto alla sintesi chimica e può generare DNA più lungo del limite di ∼120 basi per la sintesi chimica. Partendo da un campione clonale, i prodotti della PCR possono anche avere una purezza di sequenza significativamente più alta del DNA sintetizzato chimicamente. L’alta purezza di sequenza è fondamentale per le alte prestazioni nella tecnologia dei circuiti di DNA (7).

Il nostro metodo di generazione a singolo filamento (SSG) è scalabile e richiede solo un passaggio di purificazione. Questo rimuove il filamento complementare indesiderato ed esegue la purificazione basata sulle dimensioni dal primer residuo e dai prodotti PCR indesiderati. La SSG tramite co-polimerizzazione ed elettroforesi può essere applicata al prodotto di protocolli PCR avanzati come l’assemblaggio Gibson (8) per creare prodotti lunghi a singolo filamento di sequenza arbitraria. Questo può essere utile per l’origami del DNA e altre applicazioni di auto-assemblaggio.

SSG sfrutta una modifica del DNA disponibile in commercio nota come acrydite. Questa modifica aggiunge un gruppo vinilico polimerizzabile, che si incorpora in una crescente catena polimerica di acrilammide (9). Il DNA modificato dall’acrilite è stato utilizzato per una serie di applicazioni, tra cui un idrogel commutabile (10), la cattura di mercurio (11) o PDGF (12), e per modificare il tasso di elettroforesi di sequenze specifiche (13). La nostra tecnica è superficialmente simile al metodo con cui il gruppo Church ha immobilizzato colonie di polimerasi all’interno di sottili gel di poliacrilammide. L’acrilite è fondamentale per la formazione di prodotti PCR clonali (polonie) in alcune forme di sequenziamento del DNA (14).

Nei casi in cui sono richieste quantità significative di ssDNA puro, il nostro approccio con primer modificati dall’acrilite e immobilizzazione in poliacrilammide è una valida opzione. Mostriamo anche che questa tecnica può integrare SSG, separazione delle dimensioni, e l’elettroeluizione in un unico passaggio.

Materiali e metodi

Non diversamente specificato, i reagenti sono stati acquisiti da Sigma Aldrich (St. Louis, MO) e utilizzati senza ulteriore purificazione. Il DNA è stato acquisito da IDT (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) e utilizzato senza ulteriore purificazione (per informazioni sulla sequenza, vedi Tabella supplementare S1).

Dimostrazione della cattura del filamento di acrilite

Per la dimostrazione iniziale di SSG mediante co-polimerizzazione con acrilamide e poi elettroforesi, abbiamo modificato un primer con acrilite e colorante fluorescente rosso Cy5. L’altro primer è stato acquistato con una modifica di fluoresceina verde 5′. La figura 1 mostra come il campione di DNA è stato preparato mescolando 100 μl di gel denaturante al 10% (prepolimero prima dell’inizio della polimerizzazione) con 100 μl di prodotto PCR (∼20 pMol di prodotto) e la massa appropriata di urea secca (concentrazione finale di acrilamide al 5%, concentrazione finale di urea 7 M). Il DNA/prepolimero è stato caricato in un pozzetto asciutto di un gel PAGE denaturante al 5%. Il gel è stato riscaldato come descritto di seguito, e l’elettroforesi è stata eseguita per separare il filamento verde fluorescente dal filamento rosso fluorescente immobilizzato. Il gel risultante è stato ripreso utilizzando un sistema standard di imaging del gel con illuminazione LED (FluorChem Imaging System, Protein-Simple, San Jose, CA).

Generazione e purificazione del filamento singolo (elettroforesi verticale del gel)

La PCR è stata eseguita in tutti i casi con il kit di reazione Accuprime Pfx (Life Technologies, Grand Island, NY) utilizzando 50 nM di template, 10 μM di ciascun primer e 8 cicli termici. Il prodotto di PCR è stato denaturato aggiungendo urea solida ad una concentrazione finale di 7 M in una reazione di 100 μl. La poliacrilammide è stata preparata da una soluzione stock ottenuta commercialmente del 40% di acrilammide in acqua con un rapporto 19:1 di acrilammide: bis-acrilammide (Bio-Rad, Hercules, CA). Poliacrilammide denaturante è stato preparato con concentrazioni finali di 7 M urea, 20% acrilammide, e 0,25 × tampone TBE. La polimerizzazione è stata avviata aggiungendo 1 μl di TEMED (N,N,N′,N′-tetrametilendiammina) e 10 μl 10% persolfato di ammonio ad un’aliquota di 1 mL di prepolimero acrilammide denaturante. Una porzione di questa miscela (prepolimero prima dell’inizio della polimerizzazione) è stato rapidamente miscelato 1:1 con 100 microlitri di prodotto PCR (cinque reazioni PCR 20-μl per le istruzioni del produttore, in comune) con 7 M urea (10% acrilammide, concentrazione finale). La miscela PCR/acrilammide polimerizzante è stata aggiunta ad un pozzo asciutto in un gel PAGE denaturante verticale standard. La completa polimerizzazione della PCR/acrilammide denaturante è stata garantita dal lavaggio dello spazio sopra il pozzetto con un leggero flusso di argon o azoto al 99,97% (per spostare l’ossigeno che inibisce la polimerizzazione). Dopo ∼30 min di polimerizzazione, abbiamo allestito l’impianto di elettroforesi. Schiacciare la poliacrilamide e caricare i pezzi macerati nel pozzetto ha prodotto una banda molto ampia e di forma irregolare, quindi questo approccio è stato abbandonato (dati non mostrati). Polimerizzazione all’interno del pozzo era un approccio superiore. Abbiamo riscaldato il buffer in un microonde fino all’ebollizione e abbiamo aggiunto il buffer caldo (∼80°C-90°C) al serbatoio del catodo (versando il buffer caldo sui pozzetti riempiti) per favorire il rilascio del DNA dal pozzetto. L’aggiunta del tampone caldo è stata continuata fino a quando l’impianto del gel era pieno fino al volume necessario per l’elettroforesi. Il gel contenente DNA era a diretto contatto con il buffer caldo mentre veniva applicata la tensione. Il buffer caldo dovrebbe essere applicato prontamente e non dovrebbe essere lasciato raffreddare. Abbiamo poi eseguito l’elettroforesi secondo il diagramma mostrato nella Figura 1.

SB (5 mM borato di sodio) e tamponi TBE possono essere utilizzati come tamponi di esecuzione. SB e TBE sono stati preparati a RT a pH 8.42 e 8.36 rispettivamente. A 80°C, questi valori di pH cambiano a 8,21 e 7,47 rispettivamente. Questo cambiamento di pH è transitorio. Il gel si raffredda a 30°C-40°C durante l’elettroforesi. Questo cambiamento di pH non ha causato una notevole degradazione del DNA.

Al fine di visualizzare la separazione dei due filamenti, abbiamo utilizzato primer modificati con due fluorofori diversi. Il filamento mobile è stato generato utilizzando un primer modificato con fluoresceina. Il primer (acrydite) per il filamento immobile è stato preparato con una modifica interna Cy5. Utilizzando questi due coloranti, abbiamo potuto visualizzare il progresso della separazione. Abbiamo scansionato questo gel con un gel imager (FluorChem Q, ProteinSimple, Santa Clara, CA) dopo 45 minuti di elettroforesi a 500 V.

Come approccio alternativo, il prodotto di PCR può essere preconcentrato mediante precipitazione standard con etanolo. Il pellet può poi essere dissolto in un volume minore di prepolimero di acrilamide. Nelle nostre mani, la maggiore concentrazione nel pozzetto è stata compensata dalle perdite durante la precipitazione. In alcuni casi (ad esempio, per una banda di prodotto debole) questo approccio può essere preferito.

La banda fluorescente che porta il prodotto a singolo filamento, modificato con fluoresceina è stata tagliata dal gel sotto illuminazione LED blu a ∼475 nm (Bulldog Bio, Portsmouth, NH). Il DNA è stato eluito con il metodo standard crush and soak (15). Quando il DNA eluito (recuperato) era troppo diluito per un’efficiente precipitazione con etanolo, lo abbiamo concentrato tramite estrazione con butanolo. Il prodotto è stato poi precipitato con etanolo e analizzato ulteriormente come indicato di seguito.

Analisi PAGE

I prodotti a singolo filamento marcati con fluoresceina (ssDNA rilasciato dalla PAGE denaturante) sono stati analizzati per la purezza usando la PAGE nativa. Abbiamo risospeso il prodotto a singolo filamento in 10 μl e lo abbiamo quantificato con la spettroscopia UV-Vis. Abbiamo fatto concentrazioni molari uguali di primer e prodotto a singolo filamento e abbiamo elettroforesi questi campioni e un ladder verde fluorescente da 25 bp (Jena Bioscience, Jena, Germania) su un gel PAGE nativo al 15%, che è stato visualizzato con lo scanner Storm per il segnale della fluoresceina.

Analisi del quencher

Per stabilire ulteriormente che il prodotto era effettivamente a singolo filamento, abbiamo testato l’ibridazione di un oligonucleotide complementare (sonda quench) contenente una modifica 3′ quencher. Quando correttamente ibridato, la sonda quench posizioni un quencher Iowa Black entro pochi nanometri della modifica 5′ fluoresceina sul filamento complementare. Questo provoca una forte diminuzione dell’intensità della fluorescenza. La sonda quench si ibrida solo all’ssDNA. Se il prodotto è a doppio filamento, allora l’ibridazione sarà bloccata, e la fluorescenza non sarà influenzata. Campioni triplicati da 10 μl di 100 nM di prodotti modificati con fluoresceina (prodotto PCR, prodotto SSG e controllo del primer) sono stati preparati in provette PCR. Questi sono stati misurati con un fluorimetro QuantiFluor (Promega, Madison, WI) per i valori di fluorescenza iniziale, e 1,1 equivalenti molari di DNA sonda quench sono stati aggiunti, vortexato, centrifugato, e lasciato incubare per circa 1 min. La fluorescenza è stata poi registrata per determinare se si è verificato un quenching.

Confronto di tecniche di generazione a singolo filamento per la produzione di aptameri

Al fine di accertare l’efficacia di questo metodo per la generazione di aptameri funzionali, abbiamo acquistato un modello per l’amplificazione PCR di una sequenza nota di aptameri che lega il lisozima. Abbiamo amplificato questo modello con un primer modificato con fluoresceina e un primer inverso modificato con acrilite. Abbiamo eseguito il protocollo SSG come descritto sopra. Abbiamo coniugato il lisozima a 5,8 μm carbossilato-modificato perline (Bangs Labs, Fishers, IN) dal protocollo standard di accoppiamento EDC. Queste perle sono state incubate con il prodotto SSG, DNA randomizzato fluorescente (nessuna somiglianza di sequenza per l’aptamer), e un aptamer fluorescente sintetizzato chimicamente della stessa sequenza. Abbiamo anche incubato perline non rivestite con l’aptamero fluorescente sintetizzato chimicamente come controllo negativo. Le incubazioni sono state effettuate per 30 minuti e le perline sono state poi lavate 3 volte. La citometria a flusso è stata eseguita su queste particelle con un FACScalibur (BD Bioscience San Jose, CA). La distribuzione delle intensità di fluorescenza con eccitazione di luce 488-nm è stata registrata.

Generazione di singoli filamenti e purificazione (elettroforesi su gel orizzontale)

Un gel di poliacrilammide denaturante 7 M urea è stato lanciato orizzontalmente come descritto precedentemente (16). Brevemente, 25 mL di soluzione prepolimero (7M urea, 6% acrilamide/bis-acrilamide, SB buffer) è stato avviato con 84 μl APS e 20 μl TEMED. Il prepolimero gel è stato versato in uno stampo orizzontale. Lo stampo è stato poi posto in un sacchetto di plastica, che è stato spurgato con azoto. Il gel è stato permesso di polimerizzare per 30 minuti. Fluoresceina-etichettati e acrite-etichettati DNA sono stati miscelati in 1 M fosfato di sodio a pH 8,0 e annealed aumentando la temperatura a 80 ° C e raffreddamento lento a 0,1 ° C al secondo a RT. La miscela è stata raffreddata lentamente per promuovere l’ibridazione intermolecolare tra due filamenti. La miscela prepolimero (2,5 mL) è stato avviato con l’aggiunta di 8,4 microlitri APS e 2 microlitri TEMED. Una volta miscelato, 20 microlitri di questa soluzione sono stati aggiunti alla soluzione di DNA 5 microlitri. Questo è stato poi trasferito in un pozzo asciutto nel gel di poliacrilammide. Al fine di evitare distorsioni nelle linee di campo elettrico, i pozzi rimanenti sono stati riempiti con acrilammide non contenente DNA. Il gel caricato è stato posto in un sacchetto di plastica e spurgato con azoto. Il gel è stato eseguito a 10 V/cm per 10 minuti. È stato poi fotografato utilizzando un transilluminatore a LED blu e una fotocamera digitale. Per rilasciare l’ssDNA dal gel reticolato nel pozzetto, 25 mL di tampone SB sono stati riscaldati fino all’ebollizione in un microonde. Questo buffer caldo è stato poi versato sul gel. L’elettroforesi è stata continuata a 10 V/cm per 10 minuti. Il gel è stato ripreso come descritto sopra per il confronto.

L’associazione iniziale tra il DNA marcato con fluoresceina e acrilite è stata promossa utilizzando un tampone al fosfato di sodio 1 M. Se il DNA fosse stato tenuto insieme solo dall’ibridazione, 7 M urea e lo scambio di tampone in 5 mM SB buffer durante l’elettroforesi sarebbero stati adeguati per rilasciare il DNA nel gel. Invece, era necessario il calore. Questo ha dimostrato che il filamento mobile del DNA è associato o impigliato con il gel piuttosto che con il suo filamento di DNA complementare.

Risultati e discussione

Il DNA modificato dall’acrilite è immobile sotto elettroforesi

Dei due filamenti del prodotto PCR dsDNA, il filamento di acrilite è intrappolato nel copolimero, mentre il filamento complementare è mobile. Per dimostrarlo, la PCR è stata eseguita con un primer modificato sia con l’acrilite che con un colorante rosso fluorescente (Cy5). Il primer inverso è stato modificato con fluoresceina. Il prodotto di PCR è stato polimerizzato in un gel PAGE denaturante (5%). Un diagramma schematico del processo è presentato nella Figura 1. Inizialmente, entrambi i filamenti fluorescenti verdi e rossi sono co-localizzati (gel di colore giallo). Dopo l’applicazione di tensione, solo il prodotto marcato con fluoresceina (verde) migra nel gel. L’acrydite e Cy5 filamento co-etichettato (rosso) è fissato nell’immagine finale del gel (Figura 1B). Inoltre, primer residuo dalla reazione PCR è chiaramente visibile come una seconda banda verde. Dopo l’elettroforesi, il prodotto puro, a singolo filamento può essere tagliato ed eluito per i protocolli standard di purificazione del gel.

Verifica del DNA a singolo filamento

Abbiamo isolato a singolo filamento, DNA modificato con fluoresceina tagliando ed eluendo la banda di interesse. Per dimostrare che il prodotto recuperato con questo metodo è a singolo filamento, abbiamo usato due metodi diversi. Il primo metodo è stato l’analisi del gel nativo. La Figura 2A mostra un’immagine di un gel nativo contenente il primer, il prodotto di PCR (dsDNA) e l’ssDNA purificato con questo metodo. Il gel nativo mostra una chiara separazione tra il dsDNA e l’ssDNA. Dopo la SSG con il primer di acrydite (seguita dal taglio del gel e dall’eluizione del prodotto) la maggior parte del DNA isolato è a singolo filamento.

Abbiamo confermato questo risultato utilizzando un quencher-modificato sonda di ibridazione (Figura 2B). La sonda è stata progettata per portare un quencher in prossimità della parte di fluoresceina sul prodotto ssDNA. Al momento dell’ibridazione, la molecola quencher riduce l’intensità della fluorescenza del ∼90%. Poiché la sonda si ibrida solo all’ssDNA, questo esperimento dimostra che il prodotto modificato con fluoresceina era a singolo filamento. Come controllo negativo, abbiamo anche testato il prodotto PCR dsDNA. Il prodotto PCR a doppio filamento non è stato in grado di ibridarsi alla sonda quencher; pertanto, la sua fluorescenza è rimasta praticamente invariata.

Aptamers sintetizzati dalla PCR purificati dalla co-polimerizzazione e dall’elettroforesi

L’ssDNA altamente puro è prodotto dalla nostra tecnica SSG. Abbiamo purificato i prodotti ssDNA aptamer dalla PCR usando due metodi: (i) SSG da co-polimerizzazione ed elettroforesi e (ii) una tecnica di immobilizzazione biotina-avidina descritta altrove (cioè, Polysciences scheda tecnica 753) (17,18). Single-stranded aptamers sono stati generati anche da sintesi chimica. Figura 3A mostra aptamers ssDNA generato utilizzando i tre diversi metodi. Corsia 1 è un ladder marcatore per il confronto delle dimensioni. Corsia 2 mostra il ssDNA purificato generato da PCR con un primer acrilite seguita da co-polimerizzazione con acrilammide, elettroforesi, e purificazione del gel. Solo una banda è visibile alla dimensione corretta per l’ssDNA. La corsia 3 è l’ssDNA generato dalla PCR con un primer biotinilato seguito dalla purificazione con perline magnetiche rivestite di avidina. La corsia 4 è il DNA sintetizzato chimicamente con la stessa sequenza. L’aptamero ssDNA purificato da SSG mediante co-polimerizzazione ed elettroforesi ha mostrato un’elevata purezza ssDNA.

Abbiamo poi cercato di verificare se questa procedura produceva aptameri funzionali. Per fare ciò, abbiamo generato un aptamero precedentemente descritto contro il lisozima usando la PCR con primer modificati. L’aptamero anti-lizima “Clone 1” è stato prodotto per la prima volta nel laboratorio di Ellington ed è stato originariamente selezionato come aptamero a RNA (19); altri gruppi hanno riferito che la sequenza di DNA agisce anche come aptamero (20,21). Abbiamo scoperto che sia la PCR che la sintesi chimica del DNA hanno prodotto un aptamatore funzionale. Sulla base di questi e altri esperimenti, concludiamo che questo è uno dei pochi, eccezionali casi in cui l’RNA e la sua sequenza di DNA genitore legano entrambi il bersaglio. Questo è un risultato strano e casuale; la maggior parte degli aptamers non funzionano quando vengono tradotti direttamente in una chimica diversa. Questi risultati corroborano i molti casi in letteratura che indicano che l’aptamero del clone 1 anti-lizima è un caso speciale.

L’analisi della citometria a flusso ha anche dimostrato che l’aptamero ssDNA purificato SSG è funzionale. La figura 4B mostra perline rivestite di lisozima esposte a DNA casuale, all’aptamer sintetizzato chimicamente contro il lisozima o al nostro aptamer purificato SSG contro il lisozima. Sia l’aptamero purificato SSG che quello sintetizzato chimicamente hanno mostrato un forte legame con le perline rivestite di lisozima, mentre il DNA casuale non ha mostrato alcun legame significativo con le perline di lisozima. Ciò indica che queste interazioni sono specifiche per la sequenza dell’aptamero. Le perle non rivestite non mostrano alcuna fluorescenza con o senza l’aptamero, indicando che il legame è specifico per la proteina.

Il riscaldamento libera il DNA dai pozzetti

Quando si purificano gli aptameri ssDNA dal prodotto di PCR usando il metodo SSG, è stato necessario riscaldare il gel per facilitare l’elettroforesi del DNA (vedi “Materiali e metodi”). Per capire perché questo fosse necessario, abbiamo usato la PAGE orizzontale. Senza l’applicazione del calore, il prodotto di PCR ssDNA desiderato è stato trattenuto nel pozzetto, nonostante l’uso di urea 7 M e il gradiente di tensione.

La nostra prima ipotesi era che questa ritenzione fosse dovuta agli 80 bp di ibridazione nel prodotto di PCR. Per testare questa teoria, abbiamo ridotto la complementarità a 23 bp annealing il DNA aptamer Clone 1 marcato con fluoresceina (indicato come F-Aptamer nella Figura 4) ad un primer modificato con acrilite di 23 nucleotidi (indicato come AC-Clone1-P2 nella Figura 4) ed eseguito SSG mediante co-polimerizzazione ed elettroforesi. Nonostante la relativamente breve 23 bp ibridazione, quantità significative del DNA aptamer sono stati trattenuti nel pozzo (Figura 4A, corsia inferiore). Questo ha indicato che la nostra ipotesi non era corretta in quanto il tratto di ibridazione più breve di 23 bp, che dovrebbe essere facilmente denaturato in 7 M urea, non ha permesso il rilascio del filo ssDNA desiderato dal pozzo.

Abbiamo poi testato l’ipotesi che la ritenzione dipende dalla lunghezza. Qui, abbiamo annealed un 5′-acrydite modificato 19-nucleotide-lungo oligonucleotide (indicato AC-DNA in Figura 4) a un 19-nucleotide completamente complementare, oligonucleotide marcato con fluoresceina (indicato F-DNA * in Figura 4). Nonostante la lunghezza di ibridazione simile, il DNA corto è stato facilmente purificato dal suo complemento in un gel denaturante senza l’applicazione di calore. Praticamente tutto il 19-nucleotide, filamento mobile marcato con fluoresceina entra nel gel (Figura 4A, corsia centrale). Al fine di dimostrare che l’acrilite-modificato 19-mer è stato trattenuto, un filamento modificato sia con fluoresceina e acrilite (indicato AC-DNA-F in Figura 4) è stato anche co-polimerizzato nel pozzo (corsia superiore) ed è stato trattenuto con successo. (vedi “Materiali e metodi” e Tabella S1 supplementare per la sequenza e dettagli nomenclatura)

Dopo i primi 20 minuti di elettroforesi (senza riscaldamento), era chiaro che gran parte del DNA aptamatore Clone 1 non era mobile (nonostante una lunghezza breve ibridazione). Al fine di rilasciare il DNA aptamer dal poliacrilammide, è stato necessario riscaldare il gel. Abbiamo riscaldato il tampone fino quasi all’ebollizione in un microonde e poi l’abbiamo versato sul gel nella regione dei pozzetti. L’elettroforesi è stata poi continuata per altri 20 minuti (Figura 4B, corsia inferiore), e la banda dell’aptamatore è diventata mobile. Questa nuova banda aveva la stessa mobilità della banda mobile iniziale, indicando che questa era la stessa specie aptamer. Allo stesso modo, questo era lo stesso campione di DNA che ha prodotto solo una singola banda in Figura 3A. Questo esperimento dimostra la necessità di riscaldare il gel al fine di rilasciare tutti i lunghi ssDNA dal poliacrilammide. La ritenzione del DNA nel pozzetto non è dovuta all’ibridazione ma probabilmente all’impigliamento nella matrice di poliacrilammide.

PAGINA orizzontale per la generazione di un singolo filamento e l’elettroeluizione integrata

L’uso di un gel orizzontale permette di effettuare l’elettroeluizione piuttosto che tagliare ed estrarre la banda del prodotto. L’uso di un secondo pettine di estrazione per pozzetti aggiuntivi per l’elettroeluizione e l’estrazione in PAGE orizzontale ha reso più veloce la SSG e l’elettroeluizione del DNA. Abbiamo usato il software Inkscape per progettare un pettine separato per l’elettroeluizione che era più profondo e più largo del pettine di caricamento (vedi materiale supplementare per il modello utilizzato per tagliare i pettini). Il disegno è stato tagliato al laser in acrilico con un laser cutter CO2 (vedi Figura 5, A e B).

Tipicamente, la PAGINA viene effettuata utilizzando un gel verticale tra piastre di vetro. Per lanciare un gel PAGE orizzontale, era necessario escludere l’ossigeno durante la polimerizzazione. Abbiamo effettuato la polimerizzazione in un sacchetto riempito di gas azoto (o argon) per escludere l’ossigeno. Il gel è stato colato con i due pettini, e l’elettroforesi è stata eseguita secondo le procedure standard di elettroforesi del gel orizzontale.

La figura 5C mostra un gel orizzontale per SSG mediante co-polimerizzazione ed elettroforesi con elettroeluizione. Le corsie 1-4 (dall’alto) contengono un pool di aptameri. La corsia 5 è stata lasciata vuota per evitare qualsiasi contaminazione incrociata involontaria; il primer standard nella corsia 6 era presente per distinguere la banda indesiderata. Il pool è stato amplificato utilizzando un primer modificato in acrilico e un primer marcato con fluoresceina. Il filamento modificato dall’acrilico è stato trattenuto nel pozzetto. Il prodotto marcato con fluoresceina è chiaramente visibile sotto l’illuminazione a LED blu. Abbiamo permesso al primer di correre attraverso i pozzi di estrazione e dall’altro lato del gel (vedi Figura 5D). Le bande di prodotto potrebbero quindi essere osservate avvicinarsi ai pozzetti di estrazione sotto un transilluminatore a luce blu in tempo reale. Quando le bande di prodotto è entrato i pozzi, sono stati aspirati con una pipetta. Il processo ha preso circa 1 h. Precipitazione e recupero poi proceduto come per pubblicato aptamer-selezione protocolli. Questo ha eliminato la necessità di una fase separata di separazione dei filamenti o un’estrazione notturna del gel.

Ci sono diversi metodi per isolare ssDNA da dsDNA. I metodi per purificare l’ssDNA dai prodotti della PCR includono: spostamento di mobilità indotta (22), immobilizzazione di biotina-avidina (18), digestione selettiva con una DNasi (23) e aggiunta asimmetrica di primer PCR (24). Questi metodi variano per costo, purezza e scalabilità. Uno spostamento di mobilità indotto (22) in un primer può causare problemi nell’amplificazione (ad esempio, i primer modificati con PEG possono funzionare meno bene nella PCR), e la digestione enzimatica con una DNasi (23) o la rottura chimica di un filamento lascerà impurità (oltre a introdurre un altro passaggio nel processo complessivo). L’aggiunta asimmetrica di primer PCR (24) lascerà una quantità significativa di dsDNA nel prodotto ed è altamente incline agli errori di amplificazione. Il metodo più popolare è quello di estrarre il filamento indesiderato e biotinilato usando microsfere rivestite di avidina (18). Questo metodo ha diverse insidie. Il primer non reagito occupa i siti di avidina sulle microsfere, e l’interazione biotina-avidina si rompe alla temperatura di fusione del lungo DNA a doppio filamento (25). Questo contribuisce a significative impurità di dsDNA. Metodi basati su tallone hanno costi significativi: $1.80/nMol per le microsfere di avidina più $0.50/nMol per il primer di biotina. La SSG mediante co-polimerizzazione ed elettroforesi richiede solo un primer in acrilite, che costa $0,80 per nMol. Il poliacrilammide è molto economico e scalabile. La mobilità elettroforetica è una seconda dimensione di purificazione inerente alla tecnica. Sia il filamento modificato dall’acrilite che qualsiasi primer residuo vengono rimossi dalla reazione PCR in un unico passaggio.

Abbiamo dimostrato che SSG può essere utilizzato per purificare un aptamatore funzionale. La tecnica potrebbe anche essere usata per purificare un pool di ssDNA nel corso della selezione di DNA aptamer. Inoltre, SSG può anche trovare applicazione per la generazione di ssDNA per sonde di affinità o backbone per DNA origami (3). E’ importante notare che rispetto alla sintesi chimica, la produzione di DNA tramite PCR ha una fedeltà di sequenza molto più alta, che è cruciale per applicazioni come il calcolo del DNA/circuito del DNA (26).