I tioli reagiscono con questo composto, scindendo il legame disolfuro per dare 2-nitro-5-tiobenzoato (TNB-), che si ionizza al dianione TNB2- in acqua a pH neutro e alcalino. Questo ione TNB2- ha un colore giallo.
Questa reazione è rapida e stechiometrica, con l’aggiunta di una mole di tiolo che libera una mole di TNB. Il TNB2- viene quantificato in uno spettrofotometro misurando l’assorbanza della luce visibile a 412 nm, utilizzando un coefficiente di estinzione di 14.150 M-1 cm-1 per soluzioni tampone diluite, e un coefficiente di 13.700 M-1 cm-1 per alte concentrazioni di sale, come il cloridrato di guanidinio 6 M o l’urea 8 M. Purtroppo il coefficiente di estinzione per le soluzioni diluite è stato sottostimato nella pubblicazione originale del 1959, come 13.600 M-1 cm-1, e come notato in un recente articolo, questo errore è persistito nella letteratura. Il DTNB commerciale può non essere completamente puro, quindi può richiedere la ricristallizzazione per ottenere risultati completamente accurati e riproducibili.
Il reagente di Ellman può essere usato per misurare i tioli a bassa massa molecolare come il glutatione sia in soluzioni pure che in campioni biologici, come il sangue. Può anche misurare il numero di gruppi tiolici sulle proteine.