Enzimi chiave e componentiModifica
Il processo di ricombinazione V(D)J è mediato dalla ricombinasi VDJ, che è un insieme diversificato di enzimi. Gli enzimi chiave coinvolti sono i geni che attivano la ricombinazione 1 e 2 (RAG), la deossinucleotidil transferasi terminale (TdT), e la nucleasi Artemis, un membro dell’onnipresente via di giunzione non omologa (NHEJ) per la riparazione del DNA. Diversi altri enzimi sono noti per essere coinvolti nel processo e includono la DNA-dependent protein kinase (DNA-PK), la X-ray repair cross-complementing protein 4 (XRCC4), la DNA ligase IV, il non-homologous end-joining factor 1 (NHEJ1; noto anche come Cernunnos o XRCC4-like factor), il paraloga recentemente scoperto di XRCC4 e XLF (PAXX), e le DNA polimerasi λ e μ. Alcuni enzimi coinvolti sono specifici dei linfociti (ad esempio, RAG, TdT), mentre altri si trovano in altri tipi di cellule e persino in modo ubiquitario (ad esempio, i componenti di NHEJ).
Per mantenere la specificità della ricombinazione, la ricombinasi V(D)J riconosce e si lega alle sequenze di segnali di ricombinazione (RSSs) che fiancheggiano i segmenti dei geni variabili (V), della diversità (D) e della giunzione (J). Le RSS sono composte da tre elementi: un eptamero di sette nucleotidi conservati, una regione spaziatrice di 12 o 23 paia di basi e un nonmero di nove nucleotidi conservati. Mentre la maggior parte degli RSS varia nella sequenza, le sequenze di consenso dell’eptamero e del nonmero sono rispettivamente CACAGTG e ACAAAAACC; e anche se la sequenza della regione spaziatrice è poco conservata, la lunghezza è altamente conservata. La lunghezza della regione spaziatrice corrisponde a circa uno (12 paia di basi) o due giri (23 paia di basi) dell’elica del DNA. Seguendo la cosiddetta regola 12/23, i segmenti genici da ricombinare sono di solito adiacenti a RSS di diversa lunghezza dello spaziatore (cioè, uno ha un “12RSS” e uno ha un “23RSS”). Questa è una caratteristica importante nella regolazione della ricombinazione V(D)J.
ProcessEdit
La ricombinazione V(D)J inizia quando la V(D)J ricombinasi (attraverso l’attività di RAG1) lega una RSS che fiancheggia un segmento di gene codificante (V, D, o J) e crea un nick a singolo filamento nel DNA tra la prima base della RSS (appena prima dell’eptamero) e il segmento codificante. Questo è essenzialmente energeticamente neutro (nessuna necessità di idrolisi dell’ATP) e risulta nella formazione di un gruppo idrossile 3′ libero e di un gruppo fosfato 5′ sullo stesso filamento. Il gruppo idrossile reattivo è posizionato dalla ricombinasi per attaccare il legame fosfodiestere del filamento opposto, formando due estremità del DNA: una forcina (stem-loop) sul segmento di codifica e un’estremità smussata sul segmento di segnale. Il modello attuale è che la scalfittura del DNA e la formazione della forcina si verificano su entrambi i filamenti simultaneamente (o quasi) in un complesso noto come centro di ricombinazione.
Le estremità smussate del segnale sono legate insieme a filo per formare un pezzo circolare di DNA contenente tutte le sequenze che intervengono tra i segmenti codificanti, noto come un giunto di segnale (sebbene di natura circolare, questo non deve essere confuso con un plasmide). Mentre originariamente si pensava che si perdesse durante le successive divisioni cellulari, ci sono prove che i giunti di segnale possono rientrare nel genoma e portare a patologie attivando gli oncogeni o interrompendo la funzione del gene soppressore del tumore.
Le estremità codificanti sono elaborate ulteriormente prima della loro legatura da diversi eventi che alla fine portano alla diversità giunzionale. L’elaborazione inizia quando DNA-PK si lega ad ogni estremità del DNA rotto e recluta diverse altre proteine tra cui Artemis, XRCC4, DNA ligasi IV, Cernunnos, e diverse DNA polimerasi. DNA-PK forma un complesso che porta alla sua autofosforilazione, con conseguente attivazione di Artemis. Le forcine delle estremità codificanti sono aperte dall’attività di Artemis. Se sono aperte al centro, ne risulterà un’estremità di DNA smussata; tuttavia, in molti casi, l’apertura è “fuori centro” e risulta in basi extra che rimangono su un filamento (un overhang). Questi sono conosciuti come nucleotidi palindromici (P) a causa della natura palindromica della sequenza prodotta quando gli enzimi di riparazione del DNA risolvono l’overhang. Il processo di apertura della forcina da parte di Artemis è un passo cruciale della ricombinazione V(D)J ed è difettoso nel modello murino di immunodeficienza combinata grave (scid).
In seguito, XRCC4, Cernunnos e DNA-PK allineano le estremità del DNA e reclutano la deossinucleotidil transferasi terminale (TdT), una DNA polimerasi indipendente dal template che aggiunge nucleotidi non templati (N) all’estremità codificante. L’aggiunta è per lo più casuale, ma la TdT mostra una preferenza per i nucleotidi G/C. Come con tutte le DNA polimerasi conosciute, la TdT aggiunge nucleotidi a un filamento in una direzione da 5′ a 3′.
Infine, le esonucleasi possono rimuovere le basi dalle estremità codificanti (incluso qualsiasi nucleotide P o N che possa essersi formato). Le DNA polimerasi λ e μ inseriscono poi nucleotidi aggiuntivi come necessario per rendere le due estremità compatibili per l’unione. Questo è un processo stocastico, quindi può verificarsi qualsiasi combinazione di aggiunta di nucleotidi P e N e di rimozione esonucleolitica (o nessuna). Infine, le estremità codificanti elaborate sono legate insieme dalla DNA ligasi IV.
Tutti questi eventi di elaborazione risultano in un paratopo che è altamente variabile, anche quando gli stessi segmenti genici sono ricombinati. La ricombinazione V(D)J permette la generazione di immunoglobuline e recettori delle cellule T per antigeni che né l’organismo né i suoi antenati devono aver incontrato in precedenza, permettendo una risposta immunitaria adattativa ai nuovi patogeni che si sviluppano o a quelli che cambiano frequentemente (per esempio, l’influenza stagionale). Tuttavia, uno dei principali inconvenienti di questo processo è che la sequenza del DNA deve rimanere in-frame per mantenere la corretta sequenza di aminoacidi nel prodotto proteico finale. Se la sequenza risultante è fuori quadro, lo sviluppo della cellula sarà arrestato e la cellula non sopravviverà fino alla maturità. La ricombinazione V(D)J è quindi un processo molto costoso che deve essere (ed è) strettamente regolato e controllato.