Risposte cellulari e molecolari al trattamento acuto con cocaina in cellule N2a di tipo neuronale: meccanismo potenziale per la sua resistenza alla morte cellulare

Materiali

Cultura cellulare

Le cellule N2a (CCL-131, ATCC) sono state mantenute come coltura monostrato48 ed è stata ampiamente impiegata per studi sulle sostanze d’abuso14,49,50 o sui disturbi del SNC come il Parkinson51 o le malattie di Alzheimer47,52,53. Un vantaggio di questa linea cellulare è che i sottili cambiamenti morfologici dovuti a qualsiasi esposizione chimica può essere facilmente rilevato a causa della loro dimensione delle cellule più grandi. Se non diversamente specificato, tutti gli esperimenti nel nostro studio sono stati eseguiti in rosso fenolo libero RPMI-1640 medio contenente 10% FBS. Cellule post-seminate in piastre di coltura o piatti sono stati autorizzati a crescere 4-5 giorni in incubatrice per la differenziazione spontanea di escrescenze neuritiche. Tutti gli studi sono stati ripetuti almeno due volte.

Morfologia

Per le valutazioni morfologiche delle cellule lorde, cellule colorate con violetto di cristallo37 sono state fotomicrografate utilizzando EVOS Cell Imaging Systems con obiettivo ×40. In alcuni studi, morfologia o vacuoli di cellule macchiate di violetto di cristallo sono stati presi utilizzando un microscopio invertito di contrasto di fase IX-70 Olympus. Neurite outgrowths sono stati quantificati utilizzando il software image J (National Institutes of Health).

Elettrofisiologia

Whole-cell patch clamp è stato utilizzato per registrare da cellule N2a coltivate su vetrini di plastica. I vetrini sono stati lavati tre volte con una soluzione di registrazione extracellulare contenente (in mM) 145 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glucosio e 10 HEPES (312 mOsm, pH 7.4) e sono stati incubati in questa soluzione a temperatura ambiente. Cover slips sono stati lasciati non trattati o trattati con 6.25 μM o 4 mM cocaina direttamente nella soluzione extracellulare durante la registrazione. Elettrodi di vetro (resistenza 1-5 MΩ) sono stati riempiti con soluzione intracellulare contenente (in mM) 130 KCl, 2 NaCl, 10 HEPES, e 5 EGTA (292 mOsm, pH 7.4). Le cellule sono state visualizzate in contrasto di fase con un microscopio invertito Nikon Eclipse Ti-U e allegato DS-Qi1 fotocamera digitale monocromatica.

Le registrazioni sono state effettuate con un amplificatore Axopatch 200B (Molecular Devices, CA) e digitalizzate con un sistema Digidata 1440A (Molecular Devices, CA). Correnti ioniche sono stati registrati sotto un protocollo di tensione clamp (-60 a 135 mV in passi 15 mV, 250 ms di durata). Correnti spontanee postsinaptiche sono state registrate sotto tensione continua clamp a -80 mV per 2 min. Un protocollo clamp corrente (-100 a 200 pA in passi 20 pA, 800 ms di durata) è stato utilizzato per valutare la capacità delle cellule N2a per sparare potenziali d’azione in risposta all’iniezione di corrente. I segnali sono stati filtrati a 1 kHz e campionati a 10 kHz. I dati sono stati raccolti e analizzati utilizzando il software pCLAMP 10 (Molecular Devices, CA).

Trattamenti

Una quantità nota di cocaina cloridrato è stato sciolto in fosfato-buffered salina (PBS) come stock 1 M appena prima dei saggi. Al fine di simulare in vivo concentrazioni farmacologiche di cocaina, che vanno da 1 nM a 6.25 μM, diversi stock di lavoro (0.04, 0.2, 0.4, 1, 2, 4, 8, 20, 40, 200, e 400 μM) sono stati preparati in PBS, allo stesso modo, per maggiori concentrazioni di cocaina (2, 3, e 4 mM finale), stock di lavoro di 80, 120, e160 mM sono stati preparati in PBS. Da ogni stock di lavoro, 5 microlitri di cocaina è stato aggiunto per pozzo per raggiungere le concentrazioni desiderate, nonché per evitare alterazioni del pH nel terreno di coltura 37. Volume finale in ogni pozzo era 200 μl. Mentre la selezione di concentrazioni più basse si è basata sulle relazioni di nano a basso micro molare cocaina in cellule del SNC di tossicodipendenti 13, le concentrazioni più elevate sono state basate su diversi studi in vitro 14,15,16. Cellule con mezzo da solo o uguale volume di veicolo (PBS) in mezzo servito come controlli, mentre mezzo privo di cellule è stato preso come un vuoto. Sulla base dei nostri studi precedenti in C6 astroglia-come le cellule 6, trattamenti di cocaina nel presente studio sono stati effettuati anche per 1 h per scopi di confronto. Per inciso, l’effetto della cocaina nei tossicodipendenti si esaurisce entro questo periodo per quantità tipiche e percorsi di assunzione33. In un sottoinsieme di esperimenti, le cellule in piastre a 96 pozzetti sono state pretrattate con 1 µM YM155, un inibitore del gene survivin, per 30 min, seguito dal co-trattamento con cocaina (2-4 mM) per 1 h e valutato per la vitalità cellulare, mentre in altri studi, le cellule sono state pretrattate con 5 μM PIK-75, un inibitore di Nrf-224, per 30 min prima del co-trattamento con cocaina (2-4 mM) per 1 h e valutato per la vitalità cellulare e livelli GSH.

Vitabilità e vacuolizzazione

La vitalità delle cellule è stata valutata attraverso l’assorbimento del violetto di cristallo come descritto in precedenza54,55. Il grado di vacuolizzazione delle cellule è stato quantificato in cellule fissate con glutaraldeide mediante assorbimento del colorante rosso neutro come descritto in precedenza56. Il colorante è stato estratto con etanolo al 70% e 0,37% di acido cloridrico, e l’assorbanza a 540 nm è stato preso in un lettore di piastra. Le cellule colorate con violetto di cristallo sono state utilizzate per la fotomicrografia dei vacuoli utilizzando un microscopio invertito a contrasto di fase IX-70 Olympus con un obiettivo ×40.

Microscopia video

Per la videografia dal vivo, uno degli obiettivi oculari del microscopio invertito a contrasto di fase IX-70 Olympus è stato sostituito con un sistema di videocamera oculare standard. L’uscita del connettore video è stata collegata a un computer per la visualizzazione delle immagini sul monitor utilizzando il programma software Electronic Ocular -R-AMCap, fornito da Zhejiang JinCheng Scientific & Technology Co., Ltd, (HangZhou, Cina). La documentazione video è stata presa ad una velocità di 14 fotogrammi al secondo.

Saggio di integrità della membrana cellulare

L’integrità della membrana cellulare è stata determinata misurando il rilascio di LDH citoplasmatico con il kit di saggio CytoTox 96 non radioattivo (Promega, Madison, WI) secondo le istruzioni fornite dal produttore. In breve, le cellule in piastre di microtitolazione a 96 pozzetti sono state trattate con varie concentrazioni di cocaina (2, 3 e 4 mM) per 1 h. Poi 50 μl di terreno di prova è stato trasferito in una nuova piastra a 96 pozzetti, mescolato con un volume uguale di mix di substrato dal kit, e incubato per 30 min a 37 ° C. L’assorbanza è stata presa in un lettore di piastre a 490 nm.

Misurazione dei ROS intracellulari

Le cellule in piastre da 96 pozzetti sono state trattate con cocaina a 2, 3 e 4 mM per 1 h, seguita da colorazione con un colorante permeabile alle cellule H2DCFDA (10 μM finale) per 30 min6. Dopo un lavaggio delicato e l’asciugatura all’aria delle cellule, PBS (100 μl/pozzetto) è stato aggiunto. Le piastre sono state lette con il filtro di eccitazione impostato a 485 nm e il filtro di emissione a 530 nm in un lettore automatico (BioTek™ Synergy HTX multimode micro plate reader, BioTek Instruments, Winooski, VT).

Saggio di perossidazione lipidica

Le cellule sono state seminate a una densità iniziale di 0,3 × 106 cellule per pozzetto in piastre da sei pozzetti. La perossidazione lipidica è stata misurata come descritto in precedenza57. In breve, dopo il trattamento con cocaina a 2, 3 e 4 mM per 1 h, le cellule sono state raccolte e centrifugate a 13.000 rpm su una micro centrifuga da tavolo per 6 min. Tutti i pellet di cellule sono stati sonicati in PBS in ghiaccio per 3 s e trasferiti in provette di vetro. Poi i lisati sono stati mescolati con il 30% di acido tricloroacetico e lo 0,37% di acido tiobarbiturico (TBA). La miscela è stata bollita per 10 min, raffreddata a temperatura ambiente (RT), trasferita in nuovi tubi falcon e centrifugata a 3038 × g per 10 min. Il surnatante chiaro è stato trasferito in una piastra a 96 pozzetti e l’assorbanza a 535 nm è stata misurata in un lettore di micropiastre. Il mezzo chiaro senza cellule è stato usato come bianco.

Attività metabolica mitocondriale generale e potenziale di membrana

Le cellule (2 × 104) sono state trattate con varie concentrazioni di cocaina (2, 3 e 4 mM) per 1 ora in piastre da 96 pozzetti. Poi le piastre sono state centrifugate a 304 × g per 4 min, e il mezzo contenente cocaina è stato scartato con cura. Dopo l’aggiunta di terreno fresco per le cellule (200 microlitri) immediatamente, 10 microlitri di MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5(3-carbossimetoniofenolo)-2-(4-solfofenil)-2H-tetrazolio, Promega) è stato aggiunto per pozzetto come riportato in precedenza58 e incubato per 30 min a 37 ° C. L’assorbanza è stata presa in un lettore di micropiastra a 490 nm. Potenziale di membrana è stato valutato secondo la procedura precedente46. Alla fine di 1 h di trattamento con cocaina, le cellule monostrato sono stati sovrapposti con 100 microlitri di 0,25% di glutaraldeide acquosa per la fissazione, contenente Rh 123 per produrre una concentrazione finale di 2,6 μM per 30 min a RT. Il surnatante è stato scartato, e le piastre sono state lavate con acqua e asciugate all’aria nella cappa. Infine, sono stati aggiunti 100 μl di 0,1% Triton×100 in PBS per pozzetto e incubati a 37 °C per 1 ora. Le piastre sono state lette con il filtro di eccitazione impostato a 485 nm e il filtro di emissione a 538 nm su un lettore di micropiastre multimodale BioTek™ Synergy™ HTX.

Rilevazione del lattato

Gli studi condotti su cellule coltivate in terreno contenente il 10% di FBS hanno dato valori di fondo elevati a causa dell’interazione del siero con alcuni componenti del kit (Trinity Biotech, Jamestown, NY). Quindi, nei nostri studi successivi, prima dei trattamenti, il terreno contenente 10% FBS è stato sostituito con siero ridotto (0,1% FBS) in piastre da 96 pozzetti per microtitolazione (2 × 104 cellule per pozzetto). Il reagente del kit è stato sciolto in una soluzione cromogenica che consisteva in 5,3 mM di acido vanillico, 2,9 mM di 4-aminoantipirina e circa 4 unità di perossidasi di rafano. Alla fine di 1 h di trattamento della cocaina, il reagente del kit è stato aggiunto direttamente ai pozzetti (20 μl per 200 μl) e le piastre sono state tenute in incubatrice a 37 °C per lo sviluppo del colore (5-10 min). L’assorbanza delle cellule non trattate è stata presa come controllo, mentre il mezzo privo di cellule è stato preso come bianco. L’assorbanza è stata misurata a 490 nm in un lettore di micropiastre.

Spettroscopia NMR

Il rilascio di lattato dalle cellule è stato rilevato dalla spettroscopia NMR protonica (1H+). Poiché la quantità di siero non interferisce in questo metodo, abbiamo usato il 10% di FBS nel mezzo in piastre di microtitolazione a 96 pozzetti (2 × 104 cellule/200 μl per pozzetto). Alla fine del trattamento 1 h cocaina, medio (0,15 ml per pozzetto) da tutti i replicati (n = 12) di ogni trattamento è stato messo in comune (1,8 ml) nei tubi etichettati. Medio dalle cellule non trattate è stato utilizzato come controllo. Poiché i campioni trattati contenevano 2-4 mM di cocaina, abbiamo aggiunto la cocaina (4 mM finale) al mezzo vuoto. Le analisi NMR sono state effettuate su Bruker Avance 800 (\(\nu _0\) = 800.23 MHz) che è dotato di una criosonda TCI 800S6 H-C/N-D-05 Z (l’intensità massima del gradiente di campo z è 48 G/cm). Per ottenere uno spettro NMR unidimensionale (1D), 16 transienti sono stati acquisiti e co-aggiunti con 3 s di ritardo di acquisizione. I punti di dati (32.000) sono stati impiegati per ottenere una larghezza spettrale di 7500 Hz. Il picco di acqua dominante posizionato a 4,75 ppm nello spettro è stato eliminato utilizzando la sequenza di impulsi WATERGATE W520. Una larghezza di banda di 3000 Hz lungo ogni lato del picco dell’acqua è stato dato come una finestra spettrale per osservare i picchi di soluto impiegando un tempo di ritardo di 333,3 μs per i treni di impulsi WATERGATE. Uno standard esterno, 3.3 mM soluzione acquosa DMSO, è stato preparato per la quantificazione del lattato nella soluzione del campione.

Misurazione di H2S in mezzo di coltura cellulare

Le cellule sono state seminate ad una densità iniziale di 2 × 104 per pozzetto in piastre a 96 pozzetti. Prima del trattamento con cocaina, è stato aggiunto alle cellule l’acetato di zinco acquoso all’1,64%59,60 (finale: 0,041%) per convertire il gas H2S volatile in solfuro di zinco durante il trattamento con cocaina. Dopo 1 ora di trattamento con 2, 3 e 4 mM di cocaina, 17,453 mM di solfato di N,N-dimetil-p-fenilendiammina in 7,2 M HCl (finale: 2,55 mM) e 26,18 mM di FeCl3 in 1,2 M HCl (finale: 3,83 mM) sono stati aggiunti ai pozzetti e agitati delicatamente. Le bolle nel mezzo sono state rimosse aggiungendo 5 μl di etanolo freddo a tutti i pozzetti poco prima di leggere le piastre a 670 nm in un lettore di micropiastre.

Saggio di bioluminescenza dell’ATP

Le cellule in piastre da 96 pozzetti sono state trattate con varie concentrazioni di cocaina (2, 3 e 4 mM) per 1 ora. L’ATP totale è stato misurato utilizzando il kit per il saggio delle cellule somatiche Bioluminescente ATP (FLASC, Sigma-Aldrich) secondo le istruzioni del kit fornite dal produttore. In breve, alla fine del trattamento, sono stati aggiunti 75 μl di soluzione di rilascio di ATP delle cellule somatiche per pozzetto per lisare le cellule. Poi 50 μl di lisato sono stati trasferiti in nuove piastre bianche a 96 pozzetti con fondo trasparente, che contenevano già 50 μl di enzima ATP assay mix sotto luce ridotta. La luminescenza è stata misurata immediatamente su un lettore di micropiastre BioTek™ Synergy™ HTX multi-mode.

Isolamento dell’RNA e sintesi del cDNA

Le cellule sono state seminate ad una densità di 2 × 106 in piatti di coltura da 100 mm di diametro. Al momento del trattamento, le cellule hanno raggiunto circa il 65-70% di confluenza. Dopo 1 ora di trattamento con 2-4 mM di cocaina, le cellule sono state raccolte per raschiamento e centrifugate a 1125 × g per 5 min. RNA totale è stato isolato secondo il protocollo fornito dal produttore (Qiagen Sciences, città tedesca, MD) utilizzando RNeasy mini colonne di spin. DNase I (Qiagen Sciences) trattamento è stato eseguito sulla colonna. L’RNA totale dalla colonna è stato eluito con 20 μl di acqua priva di RNasi. Ai fini della quantificazione, l’RNA in ghiaccio è stato diluito in acqua priva di RNasi in rapporto 1:10. La quantità di RNA totale è stata misurata con lo spettrofotometro Nanodrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). L’RNA ha mostrato un rapporto di >1,95 a 260/280 nm, ed è stato successivamente utilizzato per la sintesi di cDNA. Un microgrammo di RNA totale è stato utilizzato per produrre cDNA utilizzando un kit di sintesi cDNA iScript (Bio-Rad, Hercules, CA) secondo le istruzioni del produttore.

Espressione relativa mediante RT-PCR quantitativa

L’analisi dell’espressione genica di Nrf-2, survivin (Birc5) e GAPDH mediante qPCR è stata eseguita in un termociclatore iCycler con sistema di rilevamento MyiQ (Bio-Rad) utilizzando iQ SYBR Green supermix. Nrf-2, survivin, e prodotti GAPDH sono stati sintetizzati da reazioni di PCR separate, effettuate in 20 μl di volume finale con 2 μl di campione cDNA e 500 nM di primer specifici. Le condizioni di ciclo erano le seguenti: 95 °C per 10 min, seguito da 40 cicli di 95 °C per 15 s, 55 °C per 30 s e 72 °C per 30 s, mentre l’analisi della curva di fusione dopo la PCR è stata eseguita a 55-95 °C. La quantificazione relativa delle espressioni geniche è stata eseguita secondo il metodo 2-△△CT61 con GAPDH come controllo endogeno. Le sequenze di primer utilizzate per le analisi sono riportate nella tabella 1.

Saggio del GSH totale

Dopo aver trattato con diverse concentrazioni di cocaina (2-4 mM) in terreno completo per 1 h in piastre da 96 pozzetti, le cellule sono state fissate con glutaraldeide allo 0,25% per 30 minuti, seguite da un lavaggio delicato per tre volte e asciugate all’aria. GSH cellulare totale è stato valutato come descritto in precedenza62. L’assorbanza è stata misurata a 412 nm in un lettore di micropiastre.

Preparazione di lisati di cellule intere

Per i saggi enzimatici, le cellule sono state seminate a una densità di 2 × 106 in piatti da 100 mm di diametro. Dopo 1 ora di trattamento con 2-4 mM di cocaina, le cellule sono state raccolte con dei raschietti. Dopo la centrifugazione a 1620 × g per 5 min, il pellet di cellule è stato conservato a -70 °C fino a nuovo uso. Il giorno dei saggi, il pellet è stato risospeso in 0,5 ml di PBS e sonicato due volte in ghiaccio per 15 s. Il contenuto è stato trasferito in tubi eppendorf e microcentrifugato a 5000 rpm per 5 min. I surnatanti sono stati trasferiti in nuove provette e utilizzati per i saggi enzimatici. La concentrazione di proteine in ogni lisato è stata determinata utilizzando il kit per il dosaggio delle proteine BCA (Pierce, Rockford, IL) secondo le istruzioni del produttore prendendo l’albumina di siero bovino come riferimento standard.

Saggio della catalasi

È stato valutato secondo il metodo precedente63. La miscela di reazione (450 μl) in una cuvetta di quarzo conteneva 50 μl di lisato cellulare (60 μg), 250 μl di tampone fosfato 50 mM (pH 7.0). La reazione è stata avviata con l’aggiunta di 150 μl di 30 mM H2O2 (10 mM finale). La diminuzione dell’assorbanza a 240 nm è stata monitorata per 2 minuti in uno spettrofotometro Genesys 10 S UV-Vis (Thermo Scientific, Vernon Hills, IL). L’attività enzimatica è stata calcolata utilizzando il coefficiente di estinzione di 0,00706 per mmol per mm e l’unità di attività enzimatica è stata espressa come mmol H2O2 decomposto per minuto per mg di proteina. Poi l’attività enzimatica dei campioni trattati è stata confrontata con il controllo (100%).

SaggioGPx

E’ stato valutato secondo la procedura pubblicata64. La miscela di reazione (500 μl) conteneva 1 mM GSH, 0,15 mM NADPH, 0,12 unità di glutatione reduttasi (GR), 0,1 mM sodio azide in 0,1 M fosfato di potassio (pH 7,0 con 1 mM EDTA. La sodio azide è stata aggiunta alla miscela di reazione per inibire l’attività della catalasi endogena. La miscela di reazione è stata incubata con 60 μg di campione per 10 min senza NADPH, e la reazione è stata avviata con l’aggiunta di NADPH e H2O2 ad una concentrazione finale di 150 μM. Il tasso di consumo di NADPH è stato monitorato a 340 nm per 3 minuti. Un’unità di attività GPx è stata definita come la quantità di enzima necessaria per consumare 1 μmol di NADPH/min nel saggio accoppiato e l’attività è stata espressa per mg di proteina. Quindi l’attività enzimatica dei campioni trattati è stata confrontata con il controllo (100%).

Analisi statistica

I risultati sperimentali (n = numero di pozzetti messi insieme da almeno due esperimenti diversi) sono stati presentati come media ± SEM. Tutti i grafici a barre sono stati tracciati utilizzando il software GraphPad Prism, versione 3.00 (San Diego, CA). I dati sono stati analizzati per la significatività tramite ANOVA a una via e poi confrontati utilizzando i test di confronto multiplo di Dunnett o Bonferroni. I valori del test di P < 0,05 e P < 0,01 sono stati considerati significativi e altamente significativi, rispettivamente.