RNase A: Domande frequenti | AG Scientific Blog

Introduzione alle RNasi

Le ronucleasi (RNasi) sono un grande gruppo di enzimi idrolitici che degradano le molecole di acido ribonucleico (RNA). Sono nucleasi che catalizzano la scomposizione dell’RNA in componenti più piccoli. Sono una superfamiglia di enzimi che catalizzano la degradazione dell’RNA, operando ai livelli di trascrizione e traduzione.

Conformazione 3D dell’enzima ribonucleasi A

Questi enzimi sono presenti in tutte le cellule viventi e nei fluidi biologici, compresi i procarioti e gli eucarioti, e svolgono molte funzioni importanti. Le RNasi sono ubiquitarie, con una durata di vita molto breve in un ambiente non protetto. Gli effetti citotossici includono la scissione dell’RNA che porta all’inibizione della sintesi proteica e all’induzione dell’apoptosi. Questi effetti citotossici possono essere prodotti applicando la RNasi alla superficie esterna della cellula, ma è stato scoperto che la citotossicità aumenta di 1000 volte quando l’enzima viene introdotto artificialmente nel citosol, indicando l’internalizzazione nella cellula come il passo limitante della tossicità.

Le RNasi sono classificate come endoribonucleasi ed esoribonucleasi. Le endoribonucleasi sono le forme A, P, H, I, III, T1, T2, U2, V1, PhyM e V.

Le esoribonucleasi includono le forme di RNasi PH, II, R, D e T, nonché la polinucleotide fosforilasi (PNPasi), l’oligoribonucleasi, l’esoribonucleasi I e l’esoribonucleasi II. Questi enzimi scindono diverse specie di RNA in modo diverso.

Di recente, i ricercatori hanno prestato attenzione alle RNasi come possibili agenti per il trattamento del cancro. L’idea è quella di trovare un enzima che danneggi selettivamente le cellule tumorali senza colpire le cellule normali circostanti.

RNase A prodotti da AG Scientific, Inc.

Domande frequenti su RNase A

Cosa è RNase A?

La ribonucleasi A è un enzima digestivo secreto dal pancreas che “digerisce” o idrolizza specificamente i polimeri di RNA (ma non il DNA) mediante scissione endonucleasica dei legami fosfodiesteri che formano i legami covalenti tra i residui ribonucleotidici adiacenti in queste molecole.

Per cosa sta la “A” in RNasi A?

La “A” nel suo nome si riferisce non alla sua specificità di substrato, ma alla forma predominante dell’enzima prodotto dal pancreas bovino. La RNasi A è immodificata, mentre la RNasi B, la RNasi C e la RNasi D sono miscele di glicoforme.

A causa della sua disponibilità in grande quantità e alta purezza, la RNasi A è stata oggetto di un lavoro fondamentale nella chimica delle proteine e nell’enzimologia. Inoltre, varianti citotossiche e omologhi dell’enzima hanno dimostrato utilità come agenti chemioterapici.

Qual è la storia di questo enzima?

È stato usato da Christian Anfinsen per dimostrare che la sequenza degli aminoacidi determina la struttura di una proteina ripiegata ed è stato usato da Stanford Moore e William Stein per dimostrare che una specifica disposizione degli aminoacidi è usata nel centro catalitico degli enzimi.

La vibonucleasi A fu anche il primo enzima sintetizzato da R. Bruce Merrifield, dimostrando che le molecole biologiche sono semplicemente entità chimiche che possono essere costruite artificialmente. Tutti questi concetti centrali, scoperti con l’aiuto della ribonucleasi, sono stati premiati con il Nobel.

Qual è la struttura della RNasi A?

Struttura della RNasi

La sequenza relativamente piccola, 124 aminoacidi della RNasi A che ha una massa molecolare di 12.600 Da. contiene quattro residui His, due dei residui His12 e His119 sono direttamente coinvolti come residui catalitici di questo enzima. L’anello imidazolico di His12 ha un valore pK anonimo basso (pK < 6.0) che suggerisce che deve essere deprotonato per la catalisi. Al contrario, l’anello imidazolico di His119 ha un valore pK anonimamente alto (pK > 6.0) che suggerisce che deve essere protonato per la catalisi.

La ribonucleasi A è una proteina?

La RNasi A è una piccola proteina, l’enzima maturo ha solo 124 residui di aminoacidi, senza carboidrati attaccati. A differenza di altri enzimi, la RNasi A contiene 19 dei 20 acidi, mancando solo il triptofano.

Qual è il meccanismo d’azione?

His12 agisce come una base generale, accettando il protone 2′-OH dell’anello di zucchero ribonucleico sessile. Questo promuove un attacco nucleofilo da parte del 2′-O sull’atomo di fosforo (P) a carica più positiva, creando così un intermedio fosfato ribonucleotidico 2′-,3′-ciclico. La creazione di questo intermedio è facilitata dall’imidazolo di His119 che agisce come un acido generale, donando il suo protone all’atomo di ossigeno nel legame P-O-R’ suscettibile.

Per il secondo passo della reazione, le attività di acido e base generale delle catene laterali di questi due residui di His sono invertite. His12 agisce come un acido generale, donando il suo protone appena acquisito all’intermedio ribonucleotide fosfato 2′-,3′-ciclico, mentre His119 che agisce come una base generale, accettando un protone dall’acqua per promuovere un attacco idrossilico sullo stesso intermedio 2′-,3′-ciclico.

Qual è il sito di scissione della RNasi A?

La RNasi A idrolizza efficacemente i contaminanti RNA nei preparati di DNA scindendo il legame fosfodiestere tra il gruppo 3′-fosfato di un nucleotide pirimidinico (C e U) e il 5′-ribosio del suo nucleotide adiacente 1, 2, 3. L’intermedio 2′-,3′-fosfodiestere ciclico che viene generato viene poi ulteriormente idrolizzato ad un gruppo 3′-monofosfato. La RNasi A pancreatica bovina è una proteina molto stabile di 124 aminoacidi con la sua più alta attività misurata verso l’RNA a singolo filamento e un tasso di scissione due volte più veloce ai residui di citidina rispetto ai residui di uridile.

Qual è la reazione di catalisi acido/base della RNasi A?

La RNasi A usa anche la catalisi acido/base per cambiare chimicamente i suoi substrati. I residui acidi o basici dell’enzima trasferiscono protoni al o dal reagente per stabilizzare le cariche in sviluppo nello stato di transizione. Il trasferimento di protoni di solito crea gruppi lascianti migliori, rendendo la reazione più favorevole dal punto di vista energetico.

L’istidina è un residuo aminoacidico molto comune coinvolto nella catalisi, poiché l’istidina ha un valore pKa vicino al neutro, (pKa=6); quindi, l’istidina può sia accettare che donare protoni a pH fisiologico.

Qual è la stabilità della ribonucleasi A?

La ribonucleasi A è incredibilmente stabile. Per esempio, in una procedura per purificare la ribonucleasi A dal pancreas di mucca, gli estratti sono trattati con acido solforico e poi riscaldati quasi fino all’ebollizione, e la ribonucleasi A è l’unica cosa che sopravvive. Questo non è sorprendente, dato che è secreta dal pancreas e deve svolgere il suo lavoro nell’ambiente inospitale del tratto digestivo. La stabilità della ribonucleasi A è dovuta in gran parte a quattro legami disolfuro che incollano insieme diverse parti della catena.

In generale, per mantenere la stabilità, conservare e maneggiare il prodotto secondo le istruzioni del venditore.

Come viene inattivata la RNasi A?

La RNasi A è un enzima abbastanza stabile e contiene 4 ponti disolfuro, presenti in tutte le ribonucleasi pancreatiche dei mammiferi. Quando i ponti vengono rotti riduttivamente, la proteina viene denaturata e diventa inattiva. Alla riossidazione la proteina si ripiega e viene ripristinata la completa attività. È possibile, tuttavia, ridurre i ponti solo parzialmente e mantenere l’attività dell’enzima. La rimozione di 4 peptidi al terminale carbossilico distrugge l’attività dell’enzima.

Cosa inibisce la RNasi A?

Il vanadato di uridina è un potente inibitore competitivo della RNasi A. Ciò che lo rende così potente è il fatto che la sua struttura imita uno stato di transizione che è intermedio nella reazione.

Come si prepara la RNasi A da stock?

La RNasi A viene tipicamente preparata facendo bollire lo stock per 10 minuti per eliminare l’attività contaminante della DNasi senza intaccare la RNasi. Il riscaldamento a 65°C non influisce sulle RNasi.

Come ricostituire lo stock preparato di RNasi A?

La RNasi A può essere sciolta ad una concentrazione da 1 a 10 mg/ml in 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 15 mM NaCl, riscaldata a 100°C per 15 minuti per inattivare le DNasi contaminanti e raffreddata lentamente a temperatura ambiente e dispensata in aliquote.

Qual è la concentrazione operativa di questo enzima?

La concentrazione operativa raccomandata di RNase A va da 1 a 100 µg/mL a seconda dell’applicazione. L’enzima è attivo in un’ampia gamma di condizioni di reazione. A basse concentrazioni di sale (da 0 a 100 mM NaCl), RNase A scinde l’RNA a singolo e doppio filamento, nonché il filamento di RNA negli ibridi RNA-DNA.

Quali sono la temperatura di conservazione e le misure di manipolazione per questo prodotto?

Conservare in una fiala ermeticamente chiusa a -20ºC. Una volta aperto, disidratarlo su gel di silice sotto vuoto prima di riportarlo a -20ºC. Usare cautela quando si maneggia. Non usare questo composto se non sei completamente addestrato o non sei consapevole dei pericoli coinvolti.

Quali sono le applicazioni della RNasi A?

Le RNasi hanno ruoli importanti nella degradazione e nel turnover dell’RNA in tutti gli organismi. L’enzima ribonucleasi può svolgere l’elica dell’RNA complessandosi con l’RNA a singolo filamento.

RNase A è un’endoribonucleasi con funzioni nel metabolismo dell’RNA e nella regolazione dell’espressione genica.

RNase A è stata trovata a svolgere ruoli importanti in malattie come le malattie autoimmuni, le insufficienze renali e i disturbi del pancreas. Più recentemente, è stata riportata anche un’attività antitumorale per una RNasi A con proprietà citotossiche e citostatiche. I membri della superfamiglia delle RNasi A sono ampiamente espressi e presenti nel siero e nei tessuti dei mammiferi.

L’enzima può essere utilizzato per idrolizzare l’RNA da campioni di proteine. È compatibile per l’uso nei saggi di protezione RNase, per rimuovere l’RNA non specificamente legato, nell’analisi delle sequenze di RNA, per idrolizzare l’RNA contenuto in campioni di proteine e nella purificazione del DNA.

Qual è l’aspetto/forma di questo prodotto?

Si presenta come una polvere bianca cromatograficamente purificata, senza sale, liofilizzata. L’aspetto/forma del prodotto può variare a seconda del produttore.

Lettura supplementare

• Fonti di contaminazione del DNA in laboratorio
• Tiocianato di guanidina nei tamponi di lisi dell’RNA
• 8 vantaggi di scegliere AGS come fornitore di proteinasi K