Saggio clonogenico: cosa, perché e come

Un saggio clonogenico, noto anche come saggio di formazione di colonie

è un saggio di sopravvivenza cellulare in vitro. Valuta la capacità delle singole cellule di sopravvivere e riprodursi per formare colonie.1 Questo test è stato descritto per la prima volta negli anni ’50, dove è stato utilizzato per studiare gli effetti delle radiazioni sulla sopravvivenza e la crescita delle cellule tumorali e ha successivamente giocato un ruolo essenziale nella radiobiologia.2

Per misurare la clonogenicità, le cellule devono essere seminate a densità molto basse e lasciate per un periodo di 1-3 settimane per la formazione delle colonie. Le colonie vengono poi fissate, colorate con il violetto di cristallo per renderle visibili e contate. Le curve di sopravvivenza delle cellule sono tracciate per analizzare i dati. Oggi, i saggi clonogenici sono utilizzati per rispondere a una varietà di domande sperimentali, soprattutto in biologia del cancro.

Questo blog mette in evidenza:

Come eseguire un test clonogenico con importanti considerazioni da fare lungo il percorso

Utilizzare la microscopia senza etichetta e il rilevamento della confluenza per valutare il numero e la dimensione delle colonie utilizzando la quantificazione automatica dell’immagine

Il test di sopravvivenza clonogenica

I test clonogenici sono ampiamente utilizzati nel campo della ricerca sul cancro in quanto la formazione di cloni è interpretata come una caratteristica delle cellule tumorali con capacità di iniziare un tumore. Mentre questo test è stato inizialmente utilizzato nel campo della radio-biologia, è diventato uno strumento standard nella ricerca sul cancro per valutare la crescita cellulare e gli effetti citotossici o genotossici di vari agenti con potenziale applicazione clinica. Questo include agenti chemioterapici e terapie mirate da soli o in combinazione 3.

La crescita clonogenica è anche usata per valutare la staminalità di particolari popolazioni di cellule, poiché le cellule staminali sono cellule che vivono a lungo con il potenziale di proliferazione continua. Questo è particolarmente rilevante per la ricerca sul cancro, poiché le cellule staminali del cancro sono spesso associate alla chemioresistenza, alla formazione di tumori secondari e alla recidiva del cancro. Pertanto, lo studio della staminalità del cancro utilizzando un test clonogenico è uno strumento prezioso e ampiamente utilizzato per prevedere l’efficacia di una particolare terapia.4

I test clonogenici misurano la capacità delle cellule di mantenere la loro integrità riproduttiva per un periodo di tempo prolungato. Questa è una caratteristica importante perché rivela effetti fenotipici che richiedono tempo e possibilmente diverse divisioni cellulari per svilupparsi. Quando si analizza la resistenza terapeutica questo è particolarmente importante. La resistenza ai farmaci non può essere identificata utilizzando saggi di citotossicità a breve termine.5

Come eseguire un test clonogenico

Le informazioni in questa sezione sono adattate da Franken et al. (2006) che hanno pubblicato un protocollo di test clonogenico in Nature Protocols1, combinato con alcune intuizioni dalla mia esperienza acquisita eseguendo oltre 60 test clonogenici durante il mio dottorato.

In sostanza, ci sono due modi diversi per eseguire un test clonogenico:

(1) Le cellule possono essere seminate a basse densità e poi trattate per esaminare l’effetto del trattamento sulla clonogenicità delle cellule.

(2) Le cellule possono essere trattate per un determinato periodo e poi ri-piantate a basse densità in mezzi senza trattamento per testare la capacità clonogenica.

Quest’ultimo è spesso usato per valutare la resistenza terapeutica dopo il trattamento. La figura 1 riassume il primo approccio che è il metodo tradizionale per eseguire un test clonogenico. Come diventerà chiaro, questo è un metodo che richiede tempo e non fornisce informazioni sulla progressione dell’esperimento (solo endpoint). Discuteremo più tardi i metodi alternativi automatizzati e non endpoint.

Protocollo tradizionale per saggi clonogenici

Figura. 1 | Un riassunto di un protocollo clonogenico tradizionale in cui le cellule sono seminate, trattate e poi valutate per la clonogenicità.

I saggi clonogenici sono tipicamente eseguiti in piastre da 6 o 24 pozzetti. Le cellule hanno bisogno di essere placcate in modo sparso e uniforme in modo che si possano formare colonie isolate. Pertanto, è importante ottimizzare la densità di semina per la dimensione del pozzetto scelto prima di eseguire il test clonogenico.

Un buon punto di partenza è quello di guardare nella letteratura per vedere se alcuni studi hanno eseguito saggi clonogenici con la vostra linea cellulare e poi testare questa densità di semina e due o tre altri. Durante questo processo di ottimizzazione, è anche importante considerare il tuo end-point sperimentale (ad esempio 7 giorni, 14 giorni o 21 giorni) e il tasso di crescita cellulare, in quanto non vuoi colonie di fusione, che interferirà con la quantificazione delle colonie e l’analisi. Le densità di semina dovrebbero essere le stesse per tutte le condizioni di trattamento all’interno del tuo esperimento.
Utilizzare i giusti controlli è fondamentale per la fase di analisi. Si dovrebbe sempre usare un controllo non trattato così come un controllo di solo veicolo (questo potrebbe essere DMSO, PBS, o qualsiasi solvente il trattamento è sciolto in). Per le condizioni di trattamento, viene spesso usata una serie di diluizioni. Il periodo di trattamento e la durezza del tuo trattamento ti aiuteranno a determinare il tuo intervallo di concentrazione – questo probabilmente richiederà una certa ottimizzazione. Ogni controllo e condizione sperimentale dovrebbe essere eseguita in triplicato.

Durante la fase di formazione delle colonie è necessario monitorare la crescita delle colonie in tutte le condizioni di trattamento. Una colonia è considerata essere 50 cellule o più e sono visibili solo al microscopio. Poiché questo saggio è in genere per un lungo periodo, sarà necessario cambiare i media delle cellule. Le cellule saranno ad una confluenza molto bassa per iniziare, quindi non sarà necessario cambiare i media regolarmente come normale. Tuttavia, se state seminando e poi trattando con un farmaco o un composto, è importante considerare la sua emivita e aggiungere un trattamento fresco come necessario.

Per i ricercatori che sono interessati all’imaging della crescita della colonia nel tempo. Si consiglia di guardare il CytoSMART Omni.

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Sono spesso le colonie nelle condizioni di controllo che crescono più velocemente e quindi puoi usare queste cellule come indicazione del tuo punto finale sperimentale, cioè terminare l’esperimento prima che le colonie inizino a fondersi e se questo accade troppo velocemente, usa piuttosto una densità di semina inferiore per il tuo esperimento. È importante terminare l’esperimento per tutte le condizioni di trattamento allo stesso tempo.

Una volta raggiunto il punto finale dell’esperimento, le cellule devono essere lavate delicatamente con PBS (aggiungere il PBS al lato del pozzo per non interrompere le colonie), fissato, e colorato con il colorante intercalare DNA, crystal violet (0,5% p/v) per almeno 30 minuti. La rimozione della macchia in eccesso può essere disordinata. La tecnica migliore è quella di immergere delicatamente le piastre in becher immersi nell’acqua fino a quando tutta la macchia in eccesso è stata rimossa e sono rimaste solo le colonie viola brillante. Le colonie colorate possono essere contate fino a 50 settimane dopo la colorazione. Scattate foto ad alta risoluzione dei vostri pozzetti da utilizzare per analisi, presentazioni e pubblicazioni.

Per supportare i ricercatori nell’analisi e nell’ottimizzazione dei loro saggi di formazione delle colonie, CytoSMART ha introdotto un’applicazione per il CytoSMART Omni per rilevare le colonie in immagini (time-lapse) di intere piastre di pozzetti con ingrandimento 10X. Nell’incubatore l’imaging time-lapse può fornire informazioni cinetiche piuttosto che end-point, che possono fornire informazioni più dettagliate su quando il trattamento inizia a influenzare le cellule. L’analisi dell’immagine senza etichetta è usata per rilevare le colonie, valutare la loro dimensione e circolarità. Individuare con precisione quando le colonie iniziano a fondersi e ottimizzare di conseguenza.

Come analizzare il tuo test clonogenico

È davvero semplice come contare manualmente le colonie per ogni condizione di trattamento e rappresentare i dati come una curva di sopravvivenza (dovresti usare almeno tre ripetizioni biologiche per la tua curva).

Una curva di sopravvivenza richiede che la frazione di sopravvivenza (SF) delle cellule trattate (questo include un rapporto tra le colonie formate e le cellule seminate) sia calcolata e tracciata contro la dose di trattamento. Prima di poter calcolare la SF, è necessario determinare l’efficienza di placcatura (PE) delle tue cellule, poiché diverse linee cellulari hanno diverse efficienze di placcatura e questo influenza il calcolo della frazione di sopravvivenza.

PE è il rapporto tra il numero di colonie e il numero di cellule seminate nelle tue cellule non trattate1. Figura 1 mostra le formule PE e SF e un esempio di una curva di sopravvivenza.

Il conteggio manuale delle colonie è noioso e può essere incline a bias, così un certo numero di strumenti di analisi di immagine computerizzata liberamente disponibili sono stati sviluppati per analizzare le immagini di saggio clonogenico rapidamente e oggettivamente. Una menzione degna è il pacchetto software liberamente disponibile sviluppato da Brzozowska et al. (2019) che non solo conta le colonie, ma anche le trame loro distribuzioni di dimensioni che è un altro strato di informazioni utili comportamento cellulare (vedi figura 2a).6

Un’alternativa al conteggio e quantificazione delle singole colonie, è la determinazione della percentuale della zona bene che è coperto da colonie (percentuale area colonia) per quantificare la crescita cellulare clonogenica. Guzmán et al. (2014) ha sviluppato un plugin ImageJ liberamente disponibile chiamato ColonyArea che fa proprio questo (vedi figura 2b).7Questo è uno strumento utile da utilizzare se si dispone di colonie fuse che sono difficili da contare a occhio o da software di conteggio delle colonie o se si desidera un metodo di analisi veloce e ad alta produttività.

Figura. 2 | Strumenti di misurazione del saggio clonogenico liberamente disponibili. (A) Brzozowska et al. sviluppato un software (countPHICS) che conta le colonie e misura le dimensioni delle colonie.6 (B) Guzmán et al. sviluppato un plugin ImageJ, ColonyArea, che quantifica l’area di crescita delle colonie e l’intensità di colorazione.7

Protocollo di saggio clonogenico senza etichetta, non endpoint, semi-automatico

Un recente documento di Mayr et al. (2018), descrive un nuovo e modificato protocollo di saggio clonogenico che utilizza un formato di micropiastra a 96 pozzetti e il rilevamento della confluenza per misurare le colonie. Questo metodo consente configurazioni sperimentali complete utilizzando una piastra a 96 pozzetti, è senza etichetta, non ha nessun punto finale di colorazione, e l’analisi è semi-automatica (figura 3)8. Inoltre, tempo risolto, non endpoint confluenza misurazione dello stesso pozzo ha dimostrato che l’analisi semi-automatica era adatto per determinare il numero di colonie e dimensioni medie.

Figure. 3 | Mayr et al. hanno valutato la crescita clonogenica nel formato a 96 pozzetti nel tempo utilizzando il rilevamento della confluenza8. Il grafico mostra la quantificazione della crescita clonogenica a diversi timepoint e le immagini mostrano pozzi specifici con rilevamento confluenza. Macchie verdi rappresentano aree rilevate da un lettore di confluenza e frecce arancioni indicano colonie fuse.

Questo metodo di saggio clonogenico fornisce un tempo e costo efficace alternativa al protocollo standard di saggio clonogenico. Senza la necessità di fissare e colorare il punto finale, questo protocollo consente il monitoraggio continuo e l’analisi della crescita clonogenica. Inoltre, ulteriori metriche circa la cinetica della crescita delle colonie può anche essere estratto durante l’esperimento. Il formato miniaturizzato apre anche l’opportunità di testare trattamenti costosi come siRNA-based o CRISPR/Cas9 terapie basate che non sarebbe fattibile con il volume di trattamento richiesto per una piastra a 6 o 24 pozzetti. In definitiva, Mayr et al. hanno dimostrato che la microscopia senza etichetta con rilevamento della confluenza è un’opzione robusta e fattibile per misurare la clonogenicità.

Una soluzione senza etichetta, senza endpoint e automatizzata per i vostri saggi clonogenici è il CytoSMART Omni con il suo algoritmo di rilevamento delle colonie. La formazione delle colonie viene misurata nel tempo attraverso un intero pozzetto con letture del conteggio delle colonie, delle dimensioni e della circolarità. Le vostre cellule non devono lasciare l’incubatore e si possono ottenere informazioni cinetiche cellulari durante il processo di formazione delle colonie (figura 4).

Figura 4 | Rilevamento automatizzato delle colonie utilizzando il CytoSMART Omni. Le cellule di cancro al fegato HEP-G2 in una piastra da 24 pozzetti sono state fotografate per 75 ore utilizzando il CytoSMART Omni che è tenuto all’interno di un incubatore standard di CO2. L’immagine mostra un pozzetto pieno dopo l’esecuzione dell’algoritmo di rilevamento delle colonie con gruppi di cellule evidenziati dalla maschera arancione delle colonie. Il conteggio delle colonie, le dimensioni e la circolarità sono stati misurati per tutta la durata del test e mostrati nei grafici.

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