Spettrometria di massa tandem

La frammentazione degli ioni in fase gassosa è essenziale per la spettrometria di massa tandem e avviene tra le diverse fasi dell’analisi di massa. Ci sono molti metodi utilizzati per frammentare gli ioni e questi possono risultare in diversi tipi di frammentazione e quindi diverse informazioni sulla struttura e la composizione della molecola.

Frammentazione in-sourceEdit

Spesso, il processo di ionizzazione è sufficientemente violento da lasciare gli ioni risultanti con sufficiente energia interna per frammentare all’interno dello spettrometro di massa. Se gli ioni prodotti persistono nel loro stato di non-equilibrio per una quantità moderata di tempo prima dell’autodissociazione, questo processo è chiamato frammentazione metastabile. La frammentazione in-source si riferisce all’induzione intenzionale della frammentazione in-source aumentando il potenziale dell’ugello-skimmer su strumenti solitamente basati sull’elettrospray. Anche se la frammentazione in-source permette l’analisi della frammentazione, non è tecnicamente la spettrometria di massa tandem a meno che gli ioni metastabili siano analizzati in massa o selezionati prima dell’autodissociazione e una seconda fase di analisi sia eseguita sui frammenti risultanti. La frammentazione in-source può essere utilizzata al posto della spettrometria di massa tandem attraverso l’utilizzo della tecnologia Enhanced in-Source Fragmentation Annotation (EISA) che genera una frammentazione che corrisponde direttamente ai dati della spettrometria di massa tandem. I frammenti osservati da EISA hanno una maggiore intensità di segnale rispetto ai frammenti tradizionali che subiscono perdite nelle celle di collisione degli spettrometri di massa tandem. L’EISA permette l’acquisizione di dati di frammentazione su analizzatori di massa MS1 come gli strumenti a tempo di volo e a quadrupolo singolo. La frammentazione in-source è spesso utilizzata in aggiunta alla spettrometria di massa tandem (con frammentazione post-source) per consentire due fasi di frammentazione in uno pseudo MS3-tipo di esperimento.

Dissociazione indotta da collisioneModifica

La frammentazione post-source è più spesso ciò che viene utilizzato in un esperimento di spettrometria di massa tandem. L’energia può anche essere aggiunta agli ioni, che di solito sono già eccitati vibrazionalmente, attraverso collisioni post-sorgente con atomi o molecole neutre, l’assorbimento di radiazioni, o il trasferimento o la cattura di un elettrone da parte di uno ione multiplo carico. La dissociazione indotta da collisione (CID), chiamata anche dissociazione attivata da collisione (CAD), comporta la collisione di uno ione con un atomo o una molecola neutra in fase gassosa e la successiva dissociazione dello ione. Per esempio, consideriamo

AB + + M ⟶ A + B + + M {displaystyle {{AB+}+ M -> {A+ {B+}+ M}}

dove lo ione AB+ si scontra con la specie neutra M e successivamente si rompe. I dettagli di questo processo sono descritti dalla teoria della collisione. A causa della diversa configurazione strumentale, sono possibili due tipi principali di CID: (i) beam-type (in cui gli ioni precursori sono frammentati on-the-flight) e (ii) ion trap-type (in cui gli ioni precursori sono prima intrappolati e poi frammentati).

Un terzo e più recente tipo di frammentazione CID è la dissociazione collisionale ad alta energia (HCD). L’HCD è una tecnica CID specifica degli spettrometri di massa orbitrap in cui la frammentazione avviene all’esterno della trappola ionica, avviene nella cella HCD (in alcuni strumenti chiamata “ion routing multipole”). HCD è una frammentazione di tipo trappola che ha dimostrato di avere caratteristiche di tipo fascio. Esistono database di spettrometria di massa tandem ad alta risoluzione liberamente disponibili su larga scala (ad esempio METLIN con 850.000 standard molecolari ciascuno con dati sperimentali CID MS/MS), e sono tipicamente utilizzati per facilitare l’identificazione delle piccole molecole.

Metodi di cattura e trasferimento di elettroniModifica

L’energia rilasciata quando un elettrone viene trasferito o catturato da uno ione con carica multipla può indurre la frammentazione.

Dissociazione con cattura di elettroniModifica

Se un elettrone viene aggiunto a uno ione positivo con carica multipla, l’energia di Coulomb viene liberata. L’aggiunta di un elettrone libero è chiamata dissociazione a cattura di elettroni (ECD), ed è rappresentata da

n + + e – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ ⟶ frammenti {displaystyle ^{n+}+{e^{-}->}} a sinistra^{(n-1)+}} a destra]^{*}{{ce {->frammenti}}

per una molecola multiprotonata M.

Dissociazione da trasferimento di elettroniModifica

L’aggiunta di un elettrone attraverso una reazione ione-ione è chiamata dissociazione da trasferimento di elettroni (ETD). Simile alla dissociazione a cattura di elettroni, l’ETD induce la frammentazione dei cationi (ad esempio peptidi o proteine) trasferendo loro degli elettroni. È stata inventata da Donald F. Hunt, Joshua Coon, John E. P. Syka e Jarrod Marto all’Università della Virginia.

ETD non usa elettroni liberi ma impiega anioni radicali (ad esempio antracene o azobenzene) per questo scopo:

n + + A – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ + A ⟶ frammenti {{displaystyle ^{n+}+{{{A^{-}->}} a sinistra^{(n-1)+}} a destra]^{*}+{A->frammenti}}

dove A è l’anione.

ETD taglia in modo casuale lungo la spina dorsale del peptide (ioni c e z) mentre catene laterali e modifiche come la fosforilazione vengono lasciate intatte. La tecnica funziona bene solo per gli ioni di stato di carica superiore (z>2), tuttavia rispetto alla dissociazione indotta da collisione (CID), l’ETD è vantaggiosa per la frammentazione di peptidi più lunghi o addirittura di intere proteine. Questo rende la tecnica importante per la proteomica top-down. Molto simile all’ECD, l’ETD è efficace per i peptidi con modifiche come la fosforilazione.

La dissociazione per trasferimento di elettroni e collisione ad alta energia (EThcD) è una combinazione ETD e HCD in cui il precursore del peptide è inizialmente sottoposto a una reazione ione/ione con anioni fluorantene in una trappola ionica lineare, che genera c- e z-ioni. Nella seconda fase la frammentazione HCD all-ion viene applicata a tutti gli ioni derivati da ETD per generare ioni b e y prima dell’analisi finale nell’analizzatore orbitrap. Questo metodo impiega la frammentazione doppia per generare spettri MS/MS ricchi di ioni e quindi dati per il sequenziamento del peptide e la localizzazione PTM.

Dissociazione negativa di trasferimento di elettroniModifica

Frammentazione può verificarsi anche con una specie deprotonata, in cui un elettrone viene trasferito dalla specie a un reagente cationico in una dissociazione di trasferimento di elettroni negativi (NETD):

n – + A + ⟶ ( n + 1 ) – ] ∗ + A ⟶ frammenti {displaystyle ^{n-}+{{A+->}} a sinistra^{(n+1)-} a destra]^{*}+{A->frammenti}}

In seguito a questo evento di trasferimento, l’anione carente di elettroni subisce un riarrangiamento interno e si frammenta. NETD è l’analogo ionico della dissociazione per distacco di elettroni (EDD).

NETD è compatibile con la frammentazione di peptidi e proteine lungo la spina dorsale del legame Cα-C. I frammenti risultanti sono solitamente ioni prodotto di tipo a e x.

Dissociazione per distacco di elettroniModifica

La dissociazione per distacco di elettroni (EDD) è un metodo per frammentare le specie anioniche nella spettrometria di massa. Serve come modalità di contrasto negativo alla dissociazione a cattura di elettroni. Gli ioni caricati negativamente sono attivati dall’irradiazione con elettroni di moderata energia cinetica. Il risultato è l’espulsione di elettroni dalla molecola ionica genitore, che provoca la dissociazione tramite ricombinazione.

Dissociazione da trasferimento di caricaModifica

La reazione tra peptidi caricati positivamente e reagenti cationici, nota anche come dissociazione da trasferimento di carica (CTD), è stata recentemente dimostrata come una via di frammentazione alternativa ad alta energia per peptidi di stato a bassa carica (1+ o 2+). Il meccanismo proposto di CTD utilizzando cationi di elio come reagente è:

1 + + He + ⟶ 2 + ] ∗ + He 0 ⟶ frammenti {displaystyle {{^{1}}+He+->}} a sinistra^{2}+}} a destra]^{*}+ {He^{0}->frammenti}}

I primi rapporti indicano che il CTD causa la scissione del legame Cα-C della spina dorsale dei peptidi e fornisce ioni prodotto di tipo a– e x.

FotodissociazioneModifica

L’energia richiesta per la dissociazione può essere aggiunta dall’assorbimento dei fotoni, con conseguente fotodissociazione degli ioni e rappresentata da

AB + + h ν ⟶ A + B + {displaystyle {{AB+}+{mathit {h\nu}->{A}+B+}}}

dove h ν {displaystyle h\nu }

rappresenta il fotone assorbito dallo ione. I laser ultravioletti possono essere usati, ma possono portare ad un’eccessiva frammentazione delle biomolecole.

Dissociazione multifotonica a infrarossiModifica

I fotoni infrarossi riscaldano gli ioni e causano la dissociazione se ne vengono assorbiti abbastanza. Questo processo è chiamato dissociazione a multifotoni nell’infrarosso (IRMPD) ed è spesso realizzato con un laser al biossido di carbonio e uno spettrometro di massa a intrappolamento di ioni come un FTMS.

Dissociazione radiativa infrarossa del corpo neroModifica

La radiazione del corpo nero può essere utilizzata per la dissociazione in una tecnica nota come dissociazione radiativa infrarossa del corpo nero (BIRD). Nel metodo BIRD, l’intera camera a vuoto dello spettrometro di massa viene riscaldata per creare luce infrarossa. BIRD usa questa radiazione per eccitare vibrazioni sempre più energetiche degli ioni, fino a quando un legame si rompe, creando frammenti. Questo è simile alla dissociazione multifotonica a infrarossi che utilizza anche la luce infrarossa, ma da una fonte diversa. BIRD è più spesso usato con la spettrometria di massa a risonanza ionica a trasformata di Fourier.

Dissociazione indotta dalla superficieModifica

Con la dissociazione indotta dalla superficie (SID), la frammentazione è il risultato della collisione di uno ione con una superficie sotto alto vuoto. Oggi, il SID è usato per frammentare una vasta gamma di ioni. Anni fa, era comune usare il SID solo su specie a massa più bassa, caricate singolarmente, perché i metodi di ionizzazione e le tecnologie degli analizzatori di massa non erano abbastanza avanzate per formare, trasmettere o caratterizzare correttamente gli ioni di alto m/z. Nel corso del tempo, le superfici monostrato auto-assemblato (SAM) composto da CF3 (CF2) 10CH2CH2S su oro sono state le superfici di collisione più utilizzati per SID in uno spettrometro tandem. I SAM hanno agito come i bersagli di collisione più desiderabili a causa delle loro caratteristiche grandi masse efficaci per la collisione degli ioni in arrivo. Inoltre, queste superfici sono composte da rigide catene di fluorocarbonio, che non smorzano significativamente l’energia degli ioni proiettati. Le catene di fluorocarbonio sono anche vantaggiose per la loro capacità di resistere al facile trasferimento di elettroni dalla superficie metallica agli ioni in arrivo. La capacità del SID di produrre sottocomplessi che rimangono stabili e forniscono informazioni preziose sulla connettività è ineguagliata da qualsiasi altra tecnica di dissociazione. Poiché i complessi prodotti dal SID sono stabili e mantengono la distribuzione della carica sul frammento, questo produce un unico, spettri che il complesso centra intorno ad una distribuzione m/z più stretta. I prodotti SID e l’energia a cui si formano riflettono le forze e la topologia del complesso. I modelli unici di dissociazione aiutano a scoprire la struttura quaternaria del complesso. La distribuzione simmetrica della carica e la dipendenza di dissociazione sono uniche per il SID e rendono gli spettri prodotti distinti da qualsiasi altra tecnica di dissociazione.

La tecnica SID è anche applicabile alla spettrometria di massa a mobilità ionica (IM-MS). Tre diversi metodi per questa tecnica includono l’analisi della caratterizzazione della topologia, della connettività intersubunità e del grado di unfolding per la struttura della proteina. L’analisi dello spiegamento della struttura proteica è l’applicazione più comunemente usata della tecnica SID. Per la spettrometria di massa a mobilità ionica (IM-MS), il SID viene utilizzato per la dissociazione dei precursori attivati alla fonte di tre diversi tipi di complessi proteici: Proteina C-reattiva (CRP), transtiretina (TTR) e concanavalina A (Con A). Questo metodo è usato per osservare il grado di unfolding per ciascuno di questi complessi. Per questa osservazione, il SID ha mostrato le strutture degli ioni precursori che esistono prima della collisione con la superficie. IM-MS utilizza il SID come misura diretta della conformazione di ogni subunità delle proteine.

La risonanza di ciclotrone ionico a trasformata di Fourier (FTICR) è in grado di fornire un’altissima risoluzione e un’elevata precisione di massa agli strumenti che effettuano misure di massa. Queste caratteristiche rendono gli spettrometri di massa FTICR uno strumento utile per un’ampia varietà di applicazioni come diversi esperimenti di dissociazione come la dissociazione indotta da collisione (CID), la dissociazione per trasferimento di elettroni (ETD) e altri. Inoltre, la dissociazione indotta dalla superficie è stata implementata con questo strumento per lo studio della frammentazione peptidica fondamentale. In particolare, il SID è stato applicato allo studio dell’energetica e della cinetica della frammentazione in fase gassosa all’interno di uno strumento ICR. Questo approccio è stato utilizzato per comprendere la frammentazione in fase gassosa di peptidi protonati, ioni peptidici a elettroni dispari, complessi ligando-peptidici non covalenti e cluster metallici legati.