Tabella 1
Eccitazione, emissione e luminosità
Se hai intenzione di utilizzare più tag fluorescenti, è importante sceglierne uno con picchi di emissione distinti – così come i picchi di eccitazione che puoi puntare con i laser disponibili. Se i picchi di emissione si sovrappongono, sarà difficile, o forse impossibile, differenziarli.
In genere si desidera il tag fluorescente più luminoso all’interno degli spettri disponibili per ottenere un segnale chiaro e superare qualsiasi potenziale fluorescenza di fondo. I valori di luminosità sono un prodotto del coefficiente di estinzione della proteina e della resa quantica. Tuttavia, il numero risultante può essere difficile da interpretare, quindi, la luminosità di un tag fluorescente rispetto a un tag ben definito, come EGFP, è una misura alternativa comune.
Maturazione e sbiancamento
La maturazione definisce il tempo necessario a un tag fluorescente per piegarsi correttamente, formare il cromoforo e iniziare a fluoresce. Per eventi sensibili al tempo in cellule vive, un breve tempo di maturazione può essere importante. Superfolder GFP (sfGFP) per esempio, può piegarsi in meno di 10 minuti, mentre mOrange può richiedere più di quattro ore.
Il bleaching è una misura della fotostabilità, cioè quanto tempo dopo l’eccitazione il cromoforo perde la capacità di emettere luce. Se hai intenzione di condurre lunghi esperimenti time-lapse, considera un tag con un’alta fotostabilità. T-sapphire ha un’emivita di sbiancamento (t½; tempo per un tasso di emissione iniziale di x fotoni/s per ridursi alla metà) di 25 secondi, ma EGFP è molto più stabile, con un t½ di sbiancamento di 174 secondi.
Condizioni ambientali
Come molte proteine, i tag fluorescenti sono influenzati dal pH, dalla temperatura e dai livelli di ossigeno. A seconda dell’ambiente che hai intenzione di utilizzare, potrebbe essere necessario regolare leggermente le condizioni o selezionare un tag più appropriato.
Il pH può influenzare i picchi di eccitazione ed emissione, e la maggior parte dei tag fluorescenti sono sensibili all’acido: alcuni possono anche cambiare l’intensità della fluorescenza ai cambiamenti di pH (es. pHTomato). Il valore pKa è un buon indicatore della sensibilità al pH in quanto mostra il pH al quale metà dei cromofori sono fluorescenti.
Inoltre, la temperatura e i livelli di ossigeno influenzano entrambi i tempi di maturazione: le condizioni ipossiche tendono a ritardare i tempi di maturazione, così come le temperature al di fuori della gamma ottimale dei tag fluorescenti (ad esempio EGFP è stato ottimizzato per funzionare a 37°C). Tuttavia, i tag fluorescenti più recenti come UnaG, una GFP isolata dall’anguilla d’acqua dolce giapponese (Anguilla japonica), fluorescente anche quando i livelli di ossigeno sono bassi3.
Ottimizzazione dei codoni
Poiché la maggior parte dei tag fluorescenti sono derivati da proteine di meduse o coralli, piuttosto che da qualcosa come le cellule e i tessuti dei mammiferi in cui è probabile utilizzarli, ci può essere una differenza interspecifica nei codoni degli aminoacidi utilizzati. Questo può portare ad una scarsa espressione e quindi ad un basso segnale.
Fortunatamente, molte delle versioni più recenti di tag fluorescenti sono state codificate per riflettere le preferenze delle cellule dei mammiferi. In GFP per esempio, Jürgen Haas e colleghi hanno migliorato il segnale di 40-120 volte modificando la sequenza di codoni di GFP4.
Se stai usando un vecchio plasmide per generare le tue proteine di fusione, potrebbe non contenere una sequenza di tag fluorescente modificata. Come tale, sempre controllare per vedere se la sequenza è stata modificata per l’uso in una certa specie.
Oligomerizzazione
E ‘importante determinare se il tag è un monomero o dimero (monomeri sono di solito indicati da un “m” prefisso il nome della proteina, ad esempio mCherry), e se questo influenza il vostro esperimento o meno. Molti dei primi tag fluorescenti erano inclini a formare oligomeri, e l’oligomerizzazione può influenzare la funzione biologica della proteina di fusione. EGFP, per esempio, è un monomero che può formare dimeri se usato in concentrazioni abbastanza elevate, che può distorcere organelli subcellulari5 o interrompere gli esperimenti come FRET6. I FP veramente monomerici sono raccomandati nella maggior parte dei casi.
Prodotti GFP e mCherry