Strumento e reagenti
Lo strumento per la rilevazione di MTX era Siemens VIVA-E che permette la personalizzazione dei parametri grazie alla disponibilità del canale aperto. I reagenti e i calibratori di MTX sono stati acquistati da Siemens (6L119UL).
Tre livelli di controllo di qualità (QC) sono stati acquistati da Bio-Rad (Irvine, CA), un ulteriore materiale QC personalizzato a 0,05 μmol/L da Aladdin (Shanghai, Cina).
Il confronto del metodo MTX è stato eseguito analizzando gli stessi campioni utilizzando la cromatografia liquida-spettrometria di massa in tandem (LC-MS/MS) (LC-20 AD Liquid Chromatography, e AB SCIEX QTRAP®4500 Mass Spectrometers).
Specifici
I campioni testati sono stati ottenuti dal reparto ematologico dell’ospedale dei bambini di Dalian. Alcuni campioni testati e campioni di plasma icterico senza MTX sono stati raccolti per studiare l’interferenza dei trigliceridi e della bilirubina. Non c’è stato alcun intervento nel trattamento dei pazienti, e nessuna informazione individuale del paziente è stata menzionata.
Preparazione dei reagenti
Il kit di reagenti Siemens contiene il reagente anticorpo/substrato A, il reagente enzimatico B, il tampone per il dosaggio dei farmaci Emit e i calibratori Emit Methotrexate. I reagenti A e B sono stati ricostituiti con 3,0 mL di acqua deionizzata, mescolati con un leggero movimento rotatorio ed equilibrati a temperatura ambiente per 1 ora. Il concentrato del tampone MTX è stato mescolato con acqua deionizzata (1:15 v/v). La soluzione di lavoro del reagente A e B è stata preparata diluendo le soluzioni stock 1:9 v/v con la soluzione tampone.
Alcuni calibratori (0, 0,20, 0,50, 1,00 μmol/L) sono stati ricostituiti alla concentrazione indicata con 1.0 mL di acqua deionizzata secondo le istruzioni del produttore, altri calibratori 1,50 e 2,00 μmol/L sono stati ricostituiti a 1,00 μmol/L con 1,50 e 2,00 mL di acqua deionizzata rispettivamente. Poi il calibratore 0,20 μmol/L è stato diluito in 0,05 μmol/L, e l’1,00 μmol/L è stato diluito in 0,10 e 0,25 μmol/L. La nuova serie di calibratori (0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50 e 1,00 μmol / L) soddisfare i requisiti della curva di calibrazione modificata.
Programmazione dello strumento Viva-E
Un canale aperto sul Viva-E è stato programmato per cambiare i volumi dei reagenti A & B da 180 μL a 110 μL (110 μL è il limite inferiore di Viva-E per i reagenti MTX). Una curva di calibrazione a sei punti è stata programmata con regressione spline cubica modificata. I sei calibratori forniti dal kit erano 0, 0,20, 0,50, 1,00, 1,50 e 2,00 μmol/L. Quando i volumi dei reagenti A e B sono stati diminuiti, non erano sufficienti per reagire con campioni superiori a 1 μmol/L. Di conseguenza, il nuovo set di calibratori del saggio EMIT modificato è stato cambiato a 0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 μmol/L in un intervallo da 0,05 a 1,00 μmol/L.
Secondo le istruzioni del kit commerciale, i campioni di concentrazione superiore a 1,00 μmol/L dovrebbero essere diluiti nell’ambito della curva di calibrazione (0.05-1.00 μmol/L) utilizzando un fattore di diluizione di 10, 100 o 1000.
Limite del bianco, limite di rilevamento, limite di quantificazione
Limit of blank (LOB), limite di rilevamento (LOD), limite di quantificazione (LOQ) sono stati determinati secondo CLSI EP17-A. Il LOB è stato calcolato utilizzando sei campioni (S1-S6, 10 replicati in 10 giorni): S1 e S2 erano calibratori di zero da due diversi lotti di calibratori, S3 e S4 erano diluenti, S5 e S6 erano plasma bianco. Il LOD è stato valutato con 5 pool di campioni a basso livello che andavano dal LOB a quattro volte il LOB (12 replicati in 12 giorni). Il LOB e il LOD sono stati determinati da due lotti di reagenti. Secondo i requisiti clinici, l’obiettivo dell’errore totale è stato fissato al 20%. I risultati dello studio LOD sono stati utilizzati per stimare il bias e l’imprecisione per ogni livello dell’analita. Poi questi dati sono stati combinati per stimare l’errore totale ad ogni livello e determinare il limite di quantificazione (LOQ).
Imprecisione intra-day e inter-day
L’imprecisione intra-day (n = 10) del test modificato è stata valutata da un livello di materiali di controllo (0,05 μmol/L) e tre livelli di campioni paziente (0,12, 0,43, 0,82 μmol/L). Ad ogni livello, sono stati eseguiti 10 replicati. L’imprecisione intergiornaliera (n = 25) è stata testata a questi 4 livelli in 5 giorni consecutivi e 5 repliche per ogni livello. Tutti i campioni sono stati ottenuti da pazienti diversi. I risultati misurati sono stati tracciati contro i valori attesi.
Linearità
La linearità è stata verificata diluendo il controllo di qualità di 2,00 μmol/L (hc) con il tampone (c0) ai seguenti rapporti: 1hc + 1c0 (1,00 μmol/L), 2hc + 3c0 (0,80 μmol/L), 1hc + 2co (0,67 μmol/L), 1hc + 3co (0.50 μmol/L), 1hc + 5co (0,33 μmol/L), 1hc + 9co (0,20 μmol/L), 1hc + 19co (0,10 μmol/L), 1hc + 39co (0,05 μmol/L). Ogni diluizione è stata analizzata tre volte, l’equazione di linearità del saggio modificato è stato calcolato sulla base delle medie dei risultati misurati e dei valori attesi.
La procedura di saggio LC-MS/MS
Il saggio LC-MS/MS eseguito in questo studio è il seguente. La difenidramina è stata usata come standard interno. L’acetonitrile è stato usato come precipitante del siero per eliminare l’albumina. Una colonna Hypersil ODS-BP C18 (5 μm, 2,1 × 150 mm) è stata utilizzata per le separazioni LC. La fase mobile era acido formico allo 0,1% e acetonitrile. L’eluizione a gradiente è stata eseguita ad una velocità di flusso di 0,5 mL/min a 30 °C. La modalità di monitoraggio di reazione multipla (MRM) è stata utilizzata per rilevare MTX e difenidramina nella sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) e nella modalità di scansione degli ioni positivi. MTX è stato rilevato a m/z 455.0 → 308.1, difenidramina è stato rilevato a m/z 256.0 → 167.0.
Confronto dei metodi
Settantanove campioni sono stati raccolti da pazienti con leucemia linfoblastica acuta nel reparto ematologico dell’ospedale dei bambini di Dalian. Ogni campione è stato testato utilizzando rispettivamente il test EMIT modificato e il test LC-MS/MS. I risultati sono stati confrontati utilizzando l’analisi di regressione lineare semplice (MedCalc Statistical Software versione 15.6.1). Altri 45 campioni sono stati testati utilizzando il saggio EMIT modificato e il saggio EMIT commerciale per il confronto del metodo.
Studi di interferenza
L’interferenza dei trigliceridi è stata valutata preparando i campioni con Intralipid (emulsione di grasso al 20%). La concentrazione di trigliceridi nei campioni era di 1000 ng/dl. Poi è stato eseguito il test Paired-T.
L’interferenza della bilirubina è stata simulata utilizzando alcuni campioni di plasma itterico senza MTX con una concentrazione di bilirubina non inferiore a 30 mg/dL.
L’interferenza del metabolita strutturalmente correlato 7-idrossi-metotrexato è stata valutata aggiungendo diversi livelli di 7-idrossi-metotrexato ai campioni di plasma, la concentrazione di MTX in questi campioni era 0,05 μmoL/L. E i risultati del test dei campioni attuali sono stati confrontati con i risultati dei campioni originali.