Tumori cheratocistici odontogeni: Fattori predittivi di ricorrenza mediante etichettatura Ki-67 e AgNOR

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Int J Med Sci 2012; 9(4):262-268. doi:10.7150/ijms.4243

Research Paper

Firat Selvi1 , Merva Soluk Tekkesin2, Sirmahan Cakarer1, S. Cemil Isler1, Cengizhan Keskin1

1. Istanbul University, Dentistry Faculty, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Istanbul, Turkey.
2. Istanbul University, Istituto di Oncologia, Dipartimento di Patologia Tumorale & Citologia, Istanbul, Turchia.

Scopo: Lo scopo del presente studio è stato quello di indagare il possibile ruolo del Ki-67 e delle regioni organizzatrici nucleari argyrophilic (AgNOR) tra i tumori cheratocistici odontogeni (KCOT) ricorrenti e non ricorrenti. Un altro obiettivo era quello di confrontare la correlazione tra questi due marcatori.

Materiali e metodi: 22 KCOTs sono stati valutati retrospettivamente. L’attività proliferativa effettiva del KCOT è stata misurata dall’indice di etichettatura Ki-67 e dal conteggio delle regioni organizzatrici nucleari argyrophilic AgNOR per nucleo. Risultati: La recidiva si è verificata in 3 pazienti (13,6%) durante il periodo di follow-up (follow-up medio, 37,8 mesi) I conteggi Ki-67 e AgNOR erano significativamente più alti nelle lesioni ricorrenti rispetto alle lesioni non ricorrenti. (p=0,045; p=0,049) La correlazione tra i conteggi Ki-67 e AgNOR è risultata positiva (r=0,853 p=0,0001).

Conclusione: Entro i limiti del presente studio, si pensa che Ki-67 e AgNOR potrebbero essere utili come marker prognostico per le recidive di KCOT. Questi marcatori hanno rafforzato il significato della nuova classificazione della lesione come tumore odontogeno. L’enucleazione con curettage o la decompressione dopo l’enucleazione con curettage è un modello chirurgico semplice e appropriato per il trattamento dei KCOT nonostante l’alto tasso di recidiva relativo. D’altra parte, il trattamento conservativo può essere scelto solo se non c’è invasione coronoidea, nessuna lisi corticale interruttiva e nessuna invasione tissulare.

Parole chiave: tumori odontogeni cheratocistici, Ki-67, AgNOR

Introduzione

Il tumore odontogeno cheratocistico (KCOT), definito dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), è una neoplasia benigna intraossea di origine dentale, con un caratteristico rivestimento di epitelio squamoso stratificato parakeratinizzato (1). La maggiore attività dell’epitelio, è stata confermata da studi precedenti che hanno confrontato le KCOT con altre cisti odontogene, può spiegare gli alti tassi di ricorrenza delle KCOT. Alcuni sono associati alla sindrome del carcinoma basocellulare nevoidale (2).

Studi immunoistochimici hanno esaminato i KCOT utilizzando vari marcatori di proliferazione e di apoptosi. L’attività proliferativa del rivestimento epiteliale dei KCOT è stata oggetto di varie indagini utilizzando diversi marcatori di proliferazione come il Ki-67 (2). Ki-67 è la proteina nucleare prototipica legata al ciclo cellulare, espressa dalle cellule proliferanti in tutte le fasi del ciclo cellulare attivo. Si degrada rapidamente dopo la mitosi con un’emivita dell’antigene rilevabile di un’ora o meno (3). La rilevazione immunoistochimica del Ki-67 è stata utilizzata per valutare il potenziale proliferativo delle cellule sane e delle lesioni preneoplastiche e neoplastiche (4).

Le regioni organizzatrici nucleari (NOR) sono anelli di DNA che trascrivono in RNA ribosomiale. La proteina legata alla NOR diventa visibile nel nucleo con una tecnica di colorazione all’argento al microscopio ottico, ed è stata chiamata proteina argyrophilic della NOR (Ag-NOR) (5). Sono stati proposti diversi metodi per determinare il tasso di proliferazione nei tumori. La colorazione all’argento degli AgNOR è considerata il miglior marcatore e il più conveniente per valutare il comportamento proliferativo di una lesione. La rapidità del turnover cellulare è valutata dalla velocità del ciclo cellulare, in modo da valutare il tasso di crescita della lesione, che è facilmente valutabile dalla conta degli AgNOR per nucleo. La quantità di AgNOR rappresenta un parametro di cinetica cellulare e può essere utilizzato a fini prognostici. È stato dimostrato che la conta di AgNOR offre un indice predittivo in vari tumori maligni (6,7).

L’interesse dei patologi per le proteine AgNOR è aumentato notevolmente verso la fine degli anni ’80 in seguito all’osservazione che le cellule maligne mostrano spesso una maggiore quantità di proteine AgNOR rispetto alle corrispondenti cellule benigne o normali. Il metodo AgNOR si è diffuso tra i patologi, in vari campi della patologia tumorale (8).

L’obiettivo del presente studio era di indagare il comportamento clinico dei KCOT per quanto riguarda la recidiva, valutando la colorazione Ki-67 e AgNOR. Un altro scopo era quello di indagare la correlazione tra questi due marcatori e dimostrare il loro possibile ruolo prognostico in queste lesioni.

Materiale e metodi

Nel presente studio, i KCOT trattati da due chirurghi orali e maxillofacciali da gennaio 2004 ad agosto 2010, sono stati rivisti retrospettivamente. Le informazioni cliniche e istologiche sono state registrate per ogni paziente. Il criterio di inclusione dello studio era la diagnosi istopatologica di “KCOT”. I casi precedentemente trattati in un altro servizio sono stati esclusi. I casi seguiti da meno di 1 anno e che erano associati alla sindrome del carcinoma basocellulare nevoidale (NBCCS) sono stati anche esclusi dallo studio. La diagnosi istopatologica si è basata sui criteri che mostrano la parakeratinizzazione dell’epitelio di rivestimento come descritto dalle linee guida dell’OMS (1).

Secondo questi criteri, un totale di 22 KCOT diagnosticati istopatologicamente sono stati selezionati per lo studio. Le radiografie panoramiche di routine sono state utilizzate prima dell’operazione. Le scansioni CT sono state utilizzate anche in base alle caratteristiche cliniche (dimensioni, posizione anatomica) del tumore. I dati includevano: età alla diagnosi, sesso dei pazienti, localizzazione della lesione, manifestazione clinica (dolore, gonfiore, infezione) modalità di trattamento e recidiva (Tabella 1).

Tutti i soggetti sono stati valutati clinicamente e radiograficamente a tempi regolari. Le radiografie panoramiche sono state fatte a 6 e 12 anni nel primo anno post-operatorio, seguite da una volta ogni anno. Il periodo medio di follow-up era di 37,8 mesi.

Macchiatura immunoistochimica

Per l’immunoistochimica, i blocchi di parafina sono stati tagliati in serie in sezioni di circa 5 μm di spessore su vetrini carichi. In primo luogo, le sezioni sono state penetrate e asciugate per una notte in autoclave (56 0C). Sono state deparaffinate con xilene per 30 minuti, lavate con alcol al 99% per 15 minuti, e poi con alcol al 96% e acqua distillata. In questo studio è stato utilizzato il kit Histostain-Plus Bulk (Zymed 2nd Generation, LAB-SA Detection System, 85-9043). Per il recupero dell’antigene, le sezioni sono state sottoposte a quattro microonde per 5 minuti in tampone citrato (Ph 6.0). L’attività della perossidasi endogena è stata bloccata incubando le sezioni con il 3% di H2O2 e lavate con acqua distillata e attese in PBS per 5 minuti. Per prevenire reazioni non specifiche, le sezioni sono state incubate con la soluzione di blocco. Ki-67 con un rapporto di diluizione di 1:50 (Zymed Laboratories, Mouse, monoclonale, clone 7B11) è stato usato come anticorpo primario. I vetrini sono stati incubati con Ki-67 per 120 minuti. L’anticorpo secondario è stato fatto reagire per 25 minuti. Il cromogeno AEC (Zymed Laboratories, 00-2007, Lot No:319293A) è stato utilizzato per visualizzare la reazione. Infine, le sezioni sono state controcolorate con ematossilina di Mayer, ricoperte e valutate al microscopio ottico.

Macchiatura AgNOR

Per la colorazione AgNOR, i blocchi di paraffina sono stati tagliati in sezioni spesse circa 5 μm. Le sezioni sono state deparaffinate con xilene per 30 minuti e lavate con alcol al 99% per 15 minuti, poi con alcol al 96% e acqua distillata. I vetrini sono stati immersi in una soluzione di acido citrico/etanolo (1:3). La soluzione di nitrato d’argento al 50% è stata mescolata in una soluzione di gelatina di 2 g/dL sciolta in 1g/dL di acido formico in proporzione 1:2 e le sezioni sono state incubate in una stanza buia per 30 minuti. Dopo aver lavato l’acqua distillata, le sezioni sono state disidratate con etanolo, ripulite con xilene, ricoperte e valutate con un microscopio ottico.

Metodi di valutazione

I vetrini immunizzati con Ki-67 sono stati esaminati con ingrandimento 400x nel microscopio Olympus BX60. Nell’epitelio, le cellule positive e negative sono state contate in 5 campi microscopici contigui e consecutivi ad alta potenza. Il numero di cellule positive è stato diviso nel numero totale di cellule contate nell’intero strato. Il risultato è stato moltiplicato per 100 per trovare la percentuale di cellule positive. I vetrini colorati con AgNOR sono stati esaminati con un ingrandimento di 1000x con olio da immersione nel microscopio Olympus BX60. Il numero di AgNOR nel nucleo è stato contato in 250 cellule per ogni caso. I punti neri/aggregati all’interno dei nucleoli cellulari sono stati contati come un punto. Il numero medio di AgNORs è stato diviso per il numero totale di cellule.

Analisi statistica

L’analisi statistica è stata aiutata dal software statistico NCSS (Number Cruncher Statistical System) 2007 (Utah, USA). Il test Chi-quadrato e il test esatto di Fisher sono stati utilizzati per valutare i parametri qualitativi. Il test Mann-Whitney-U è stato utilizzato per valutare le statistiche descrittive (mediana, intervallo interquartile) (SD) e le differenze tra i gruppi. Probabilità inferiori a 0,05 sono state accettate come significative.

Risultati

L’età dei membri del gruppo ricorrente è stata trovata statisticamente più bassa rispetto ai membri del gruppo non ricorrente (p=0,035). Nessuna differenza statisticamente significativa è stata osservata tra i gruppi ricorrenti e non ricorrenti per quanto riguarda il follow-up. (p=0,472). I valori Ki-67 del gruppo ricorrente sono stati trovati statisticamente più alti del gruppo non ricorrente. (p=0,045). I valori AgNOR del gruppo ricorrente sono stati trovati statisticamente più alti del gruppo non ricorrente (p=0,049) (Tabella 2).

La maggior parte delle cellule Ki- 67 è stata rilevata negli strati soprabasali (Figura 1) I punti AgNOR erano più alti nel nucleo delle cellule sottobasali che nelle cellule basali in KCOT (Figura 2).

Nessuna differenza statisticamente significativa e’ stata osservata tra i gruppi ricorrenti e non ricorrenti per quanto riguarda il sesso (p=0,952).

Nessuna differenza statisticamente significativa e’ stata osservata tra Kİ-67 e AgNOR per quanto riguarda la fascia di eta’.

E’ stata trovata una correlazione positiva statisticamente significativa tra i valori di Kİ-67 e AgNOR. (r=0,853 p=0,0001). (Tabella 3).

Discussione

Nel nostro studio, nessuna differenza statisticamente significativa è stata osservata tra il gruppo ricorrente e non ricorrente per quanto riguarda il genere; anche se alcuni autori ritengono che il genere potrebbe giocare un ruolo importante nel tasso di recidiva (9,10). Altri ritengono che il sesso non sia un determinante significativo della recidiva (11,12,13).

L’età dei membri del gruppo ricorrente è risultata essere statisticamente inferiore a quella dei membri del gruppo non ricorrente (p=0,035). Questa situazione era simile a quella trovata da Forssell et al e Gonzalez-Alva et al. che hanno riportato un tasso di recidiva più alto nei pazienti giovani (14, 15). Questa situazione può essere associata al fatto che i pazienti più giovani spesso ricevono un approccio più conservativo come la conservazione dei denti associati come presentato nel nostro studio.

Approcci conservativi e aggressivi sono stati riportati sulla gestione del KCOT. La scelta del trattamento deve prendere in considerazione l’età del paziente, le dimensioni della lesione, la precedente storia di recidiva, il coinvolgimento dei tessuti molli e le caratteristiche istologiche (16). Nel metodo conservativo, si suggerisce la semplice enucleazione con o senza curettage, la marsupializzazione e la decompressione. I metodi aggressivi includono: ostectomia periferica, curettage chimico con la soluzione di Carnoy, e resezione radicale di periosti, tessuti o ossa (17, 18). Il trattamento delle KCOT è ancora controverso. Una recente revisione Cochrane ha dimostrato che c’è bisogno di studi clinici controllati randomizzati ben condotti sulla gestione dei KCOT (19).

I tassi di recidiva dei KCOT riportati tendono a variare dallo 0% al 100% (2, 18, 20, 21). Queste marcate discrepanze si pensa siano legate alla diversa durata dei periodi di follow-up post-operatorio, alle tecniche operative impiegate o all’inclusione di casi con la sindrome del carcinoma basocellulare nevoidale (NBCCS). I tumori variano anche nella loro aggressività, contribuendo alla variazione dei modelli di recidiva (18). Il tasso di recidiva è più alto con la semplice enucleazione (senza curettage) e varia dal 9% al 62,5% (22). La resezione offre un alto tasso di guarigione, ma produce una morbilità significativa come la perdita della continuità della mascella o la deturpazione del viso. Dovrebbe quindi essere riservata solo a lesioni aggressive o ricorrenti, o a pazienti che non possono essere seguiti da vicino dopo trattamenti conservativi (22). Nel nostro studio, tutti i casi sono stati trattati con enucleazione con curettage come riportato da Boffano et al (23). Una fresa chirurgica è stata utilizzata per rimuovere circa 2 mm di osso corticale tutto intorno all’osso rimasto dopo l’enucleazione. Solo in 2 casi la decompressione è stata eseguita prima dell’enucleazione con curettage. Il tasso di recidiva è stato del 13,6%; simile ai rapporti che hanno mostrato l’enucleazione e il curettage come trattamento del KCOT, come presentato nel nostro studio (18, 23). D’altra parte il tasso di recidiva nel nostro studio è stato trovato come piuttosto basso rispetto ai rapporti precedenti che hanno dimostrato il metodo di enucleazione semplice come trattamento di KCOT (24,25,26, 27).

I pazienti sono ancora sotto osservazione periodica nel nostro istituto. D’altra parte è stato riportato che il KCOT può ripresentarsi anche dopo 6-25 anni dall’enucleazione (25). Pertanto non è possibile trarre conclusioni a lungo termine sui tassi di recidiva rispetto al tempo medio di follow-up (37,8 mesi) del presente studio.

È stato riportato che i KCOT localizzati nella regione molare mandibolare avevano tassi di recidiva significativamente più alti di quelli in altre sedi. Si ritiene che la difficoltà di rimuovere tutte le tracce del rivestimento epiteliale sia un fattore importante che porta alla recidiva (17). Nel nostro studio, solo una delle lesioni ricorrenti è stata osservata nella mandibola (n. 7 nella tabella 1). La lesione aveva dimensioni superiori a 5 cm e si trovava nella parte posteriore della mandibola, sollevandosi fino al processo condilare. Dopo 8 mesi di decompressione il tumore è stato enucleato con curettage. 11 mesi dopo l’enucleazione, la lesione si è ripresentata e trattata nuovamente con lo stesso approccio conservativo. La recidiva era associata al difficile accesso chirurgico, alle grandi dimensioni e anche al comportamento aggressivo biologico della lesione stessa, dimostrato dal più alto indice di etichetta Ki67 e dalla conta degli AgNORs. Non è stato possibile rimuovere il tumore in un unico pezzo. Le altre due lesioni ricorrenti sono state viste nella mascella. Le dimensioni delle lesioni erano superiori a 4 cm e le lesioni sono state rimosse in un unico pezzo. Le dimensioni dei tumori non ricorrenti variano da 1 a 5 cm. La recidiva può essere spiegata con il trattamento conservativo (resezione radicolare) dei denti associati. L’estrazione dei denti è stata ridotta al minimo. I pazienti hanno negato estrazioni multiple di denti e hanno accettato il rischio di recidiva. Pertanto si pensa che alcuni resti tumorali che erano associati ai denti possano causare la recidiva come riportato da Pogrel (28).

I KCOT nascono da cellule epiteliali odontogeniche e da resti della lamina dentale, e anche da estensioni di cellule basali dell’epitelio orale. Le cellule epiteliali nelle KCOT sembrano avere un potenziale proliferativo diverso da quelle di altre lesioni odontogeniche (4).

Gli anticorpi Ki-67 sono utili per stabilire la frazione di crescita cellulare nelle neoplasie. L’espressione Ki-67 ha dimostrato di essere più alta nell’epitelio delle KCOT rispetto alle cisti di sviluppo e infiammatorie, con la maggior parte delle cellule Ki-67 rilevate negli strati soprabasali, come riportato nel nostro studio (2, 3, 29).

Un numero limitato di studi è stato pubblicato sulla valutazione degli AgNOR nelle cisti e nei tumori odontogenici. Risultati contrastanti sono stati osservati in questi studi (6, 30,31,32,33,34). Coleman et al. hanno studiato se gli AgNOR possono essere utili per distinguere varie cisti odontogeniche dall’ameloblastoma unicistico. Hanno concluso che il conteggio degli AgNOR non ha un significato diagnostico e non può essere usato per distinguere le varie cisti odontogene l’una dall’altra né dall’ameloblastoma unicistico (30). Allison e Spencer hanno eseguito conteggi AgNOR su cisti parodontali apicali, cisti dentarie, cheratocisti odontogene, ameloblastomi e carcinomi a cellule basali. Hanno riportato differenze significative tra KCOT e cisti parodontali apicali. In quello studio i conteggi medi di AgNOR per tutte le cisti odontogeniche variavano tra 2,02 e 2,65, e per gli ameloblastomi erano 2,24. In base ai risultati hanno concluso che il metodo non aveva un valore diagnostico né prognostico in queste lesioni (34). Nel nostro studio, i punti AgNOR erano più alti nel nucleo delle cellule subrabasali rispetto alle cellule basali nel KCOT. I valori medi di AgNOR sono stati trovati più alti rispetto all’intervallo di conteggio riportato nella letteratura (6, 32, 34).

Le differenze nella letteratura possono essere associate alle differenze nel metodo di colorazione e nel protocollo di conteggio per AgNOR e a causa della differenza nella dimensione semplice. Pertanto siamo d’accordo con Gadbail et al e Eslami et al che hanno raccomandato un protocollo standard per la colorazione AgNOR e il protocollo di conteggio (6, 32).

Ci sono diversi fattori di confondimento per l’analisi della relazione tra recidiva di KCOT e variabili clinicopatologiche e immunoistochimiche. Non c’è dubbio che la gestione chirurgica è il fattore più influente per le recidive dopo qualsiasi intervento chirurgico. Tuttavia, non è stato studiato per un gruppo sottoposto a una singola procedura chirurgica per KCOT per ridurre l’influenza dei fattori di confondimento. Inoltre, si sa poco su qualsiasi relazione tra l’espressione dei marcatori proliferativi cellulari e la recidiva nel KCOT in termini di rischi ricorrenti per variabili dipendenti dal tempo (18). I risultati del nostro studio hanno dimostrato una maggiore espressione di Ki-67 e la conta di AgNOR nelle lesioni ricorrenti rispetto alle lesioni non ricorrenti. D’altra parte, Li et al, hanno riportato che nessuna differenza significativa tra lesioni semplici (non ricorrenti) e ricorrenti per quanto riguarda l’espressione di Ki-67 (35).

La limitazione di questo studio è che solo due marcatori sono stati valutati. D’altra parte, un punto importante di questo studio è la dimostrazione della correlazione positiva tra Ki-67 e AgNORs negli strati cellulari soprabasali di KCOTs. Questa correlazione positiva significativa è stata riportata anche da Gadbail et al (6).

Un altro limite è la bassa dimensione del campione delle lesioni ricorrenti. Nel nostro studio la recidiva era presente solo in 3 soggetti su 22. Allo stesso modo, Kuroyanagi et al, (18) hanno riportato 4 lesioni ricorrenti tra 32 soggetti con diagnosi di KCOT. Hanno riferito che il Ki-67 è stato trovato più alto nel gruppo ricorrente e hanno suggerito che questo marcatore può essere raccomandato come fattore prognostico. I nostri risultati consistono con Kuroyanagi et al. (18) per quanto riguarda l’espressione di Ki-67. Inoltre, secondo i nostri risultati, abbiamo raccomandato che AgNOR potrebbe essere utile come marcatore prognostico in KCOTS.

Conclusione

Ki-67 e AgNOR potrebbero essere utili come marcatore prognostico in KCOTs. Un protocollo standard è necessario per la valutazione di AgNORs. La correlazione positiva di questi marcatori ha rafforzato il carattere neoplastico dei KCOT. La maggiore espressione di questi marcatori nelle lesioni ricorrenti è importante per considerare ulteriori interventi chirurgici per migliorare la prognosi.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano “ARK Biostatistical Office” per le analisi statistiche del presente studio.

Interessi concorrenti

Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi concorrenti.

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