Il biofisico Adam Cohen stava passeggiando per San Francisco, California, nel 2010, quando una telefonata lo colse di sorpresa. “Abbiamo un segnale”, disse il chiamante. A quasi 5.000 chilometri di distanza, a Cambridge, Massachusetts, i suoi collaboratori avevano trovato l’oro. Dopo mesi di esperimenti falliti, i ricercatori avevano trovato una proteina fluorescente che permetteva loro di osservare i segnali mentre passavano tra i neuroni.
Ma c’era qualcosa di strano. Quando Cohen tornò al suo laboratorio all’Università di Harvard, apprese che tutte le registrazioni dell’esperimento mostravano una strana progressione. All’inizio, i neuroni decorati con la proteina lampeggiavano piacevolmente quando gli impulsi elettrici li attraversavano. Ma poi le cellule si sono trasformate in macchie luminose. “A metà di ogni registrazione, il segnale andava in tilt”, dice Cohen.
Così ha deciso di unirsi alla sua squadra durante un esperimento. “Quando hanno iniziato la registrazione, si sedevano lì trattenendo il respiro”, dice Cohen. Ma non appena si rendevano conto che funzionava, festeggiavano, “ballando e correndo per la stanza”.
Nella loro esuberanza, lasciavano che la luce di una lampada da tavolo brillasse proprio sul microscopio. “Stavamo effettivamente registrando la nostra eccitazione”, dice Daniel Hochbaum, allora studente laureato nel gruppo di Cohen. Hanno smorzato i loro festeggiamenti, e un anno dopo, il team ha pubblicato il suo studio1 – uno dei primi a dimostrare che una proteina fluorescente ingegnerizzata in specifici neuroni di mammifero potrebbe essere usata per tracciare singoli impulsi elettrici in tempo reale.
Gli neuroscienziati hanno cercato per decenni di osservare i rapidi segnali elettrici che sono una componente importante del linguaggio del cervello. Anche se gli elettrodi, il cavallo di battaglia per misurare la tensione, possono registrare in modo affidabile l’attività dei singoli neuroni, fanno fatica a catturare i segnali di molti, soprattutto per periodi prolungati. Ma negli ultimi due decenni, gli scienziati hanno trovato un modo per incorporare proteine fluorescenti e indicatrici di tensione nelle membrane cellulari dei neuroni. Con il giusto tipo di microscopio, possono quindi vedere le cellule illuminarsi mentre parlano tra di loro – sia in un sussurro che in un grido. L’imaging di tensione può anche registrare le chiacchiere elettriche tra molti neuroni in una sola volta, e poi calcolare la media di questi segnali su grandi porzioni di tessuto cerebrale. Questo aiuta i ricercatori a studiare l’attività elettrica del cervello su diverse scale spaziali, ascoltando non solo le voci delle singole cellule ma anche “il ruggito della folla”, dice Cohen.
Negli ultimi 5 anni, gli scienziati hanno pubblicato circa 1.000 articoli sull’argomento, e importanti schemi di finanziamento come l’iniziativa BRAIN degli US National Institutes of Health hanno accelerato lo sviluppo di nuovi tipi di indicatori di tensione geneticamente modificati. Nella speranza di trovare varianti migliori, alcuni gruppi hanno elaborato strategie per vagliare milioni di proteine per caratteristiche desiderate come la luminosità. Uno di questi approcci ha identificato un indicatore che è due volte più luminoso di sensori simili sviluppati solo quattro anni prima2.
Come queste proteine migliorano, e i progressi nella microscopia rendono più facile vederli, gli scienziati sperano di illuminare il più grande puzzle delle neuroscienze: come le cellule del cervello lavorano insieme per trasformare un sistema di impulsi elettrici in pensieri, azioni ed emozioni. I ricercatori stanno ancora lottando per catturare l’intera gamma di attività e per escogitare modi per vedere i nervi che sparano velocemente e in profondità nel tessuto cerebrale. Ma se i progressi possono risolvere queste sfide tecniche, “sarebbe rivoluzionario”, dice Rafael Yuste, che studia la funzione dei circuiti neurali alla Columbia University di New York City.
Processo ad alta velocità
Il cervello umano medio contiene circa 120 miliardi di neuroni, che ricevono e inviano costantemente informazioni attraverso appendici simili a rami chiamati dendriti. I segnali chimici o elettrici che raggiungono i dendriti producono piccoli cambiamenti di tensione attraverso la membrana della cellula, che vengono indirizzati al corpo cellulare. Quando la somma dei cambiamenti di tensione raggiunge un punto di non ritorno, chiamato soglia, il neurone spara un grande picco elettrico – un potenziale d’azione. Questa scossa sfreccia a velocità fino a 150 metri al secondo lungo un ramo neuronale, noto come assone, verso un’altra serie di appendici ramificate. Qui, i segnali chimici o elettrici passano l’informazione alla successiva serie di dendriti.
I segnali neuronali convergono, divergono e si sincronizzano per produrre una sinfonia di pensieri, emozioni, azioni e reazioni, dal rossore di un volto al singhiozzo di un bambino. Ma gli strumenti di ascolto degli scienziati sono estremamente limitati. Sviluppati per la prima volta negli anni ’40, elettrodi in miniatura sottili come un capello possono essere inseriti nel cervello, contro o all’interno dei neuroni, dove misurano la tensione di membrana con precisione e velocità. Ma questo approccio può essere usato per monitorare solo uno o una manciata di neuroni alla volta – e solo per un periodo di tempo limitato, perché gli elettrodi alla fine danneggiano la cellula. È come cercare di capire il succo di un arrangiamento orchestrale seguendo un solo suonatore per pochi secondi.
Fasci di microelettrodi possono registrare l’attività elettrica di fino a 200 cellule contemporaneamente, ma poiché questi elettrodi sono posti vicino ai neuroni piuttosto che al loro interno, possono rilevare solo i potenziali d’azione, i picchi più forti dell’attività elettrica. Sono sordi alle note più morbide – i piccoli cambiamenti elettrici che non spingono il neurone fino a un potenziale d’azione. Questi cambiamenti di tensione sottosoglia sono fondamentali per la funzione cerebrale, perché si sommano gradualmente per determinare se un neurone sparerà o meno.
Nella speranza di misurare l’attività cerebrale più tranquilla in popolazioni più grandi di cellule, gli scienziati negli anni ’60 hanno iniziato a giocare con l’idea di un sensore o sonda che diventa fluorescente in risposta a un segnale elettrico. Le sonde più popolari, chiamate indicatori di calcio, si accendono quando si legano al calcio, che scorre nel neurone come risultato di un picco di attività elettrica. Ma la tecnica, nota come calcium imaging, fornisce solo un proxy; non registra direttamente la tensione di membrana. E anche se mostrerà il segnale di grandi eventi come i potenziali d’azione, manca cose che sono cruciali per la funzione del cervello, come le sottili oscillazioni della tensione di membrana o i segnali elettrici che inibiscono i potenziali d’azione. Immaginate di poter sentire solo uno scoppio di applausi dopo un concerto sinfonico: è chiaro che l’orchestra ha suonato, ma cosa stesse suonando è un’ipotesi.
Negli anni ’70, gli scienziati hanno iniziato a sviluppare sensori di coloranti che rilevano direttamente i cambiamenti di tensione della membrana. Le prime versioni di questi coloranti dovevano essere dipinte sul cervello in modo indiscriminato, quindi etichettavano tutti i tipi di cellule, comprese quelle non neuronali, rendendo difficile analizzare l’attività di neuroni specifici.
Poi, negli anni ’90, i ricercatori hanno iniziato a testare indicatori che potevano essere geneticamente modificati per mostrarsi solo nei neuroni di interesse. Il primo3 indicatore di tensione geneticamente codificato (GEVI) è stato sviluppato nel 1997; da allora, gli scienziati hanno sfornato più di due dozzine di sensori4. Alcuni di questi sono fatti combinando una proteina sensibile alla tensione con molecole fluorescenti (vedi ‘I sapori della fluorescenza’). Quando queste proteine rilevano un cambiamento di tensione, cambiano la loro struttura 3D e alterano la fluorescenza della molecola a cui sono accoppiate. Altri indicatori di tensione sono versioni mutate delle rodopsine microbiche, molecole fluorescenti che causano un cambiamento di tensione attraverso la membrana plasmatica in risposta alla luce. Queste proteine possono anche lavorare al contrario, cambiando la loro risposta alla luce – e quindi la loro fluorescenza – in risposta a un cambiamento di tensione della membrana.
Tutto nel dettaglio
Finora i GEVI si sono dimostrati efficaci nel tracciare i singoli potenziali d’azione sia nei neuroni in coltura, cresciuti in un piatto, sia nel cervello intatto di una vasta gamma di animali, dagli insetti5 ai topi6. Una delle maggiori promesse della tecnica è il suo potenziale per registrare non solo i grandi eventi, ma anche i piccoli cambiamenti sotto soglia nella tensione di membrana che riflettono i messaggi che un neurone riceve dalle cellule vicine, dice Cohen. “Nell’ultimo anno, Cohen e i suoi colleghi hanno sviluppato nuovi GEVI e migliorato le tecniche di microscopia per registrare tali cambiamenti di tensione sottosoglia da molti neuroni contemporaneamente, anche nel cervello del topo7,8. Il team è stato anche in grado di registrare l’attività elettrica degli stessi neuroni fino a una settimana dopo. La capacità di sapere esattamente quali neuroni vengono registrati e di tenerne traccia nel tempo permette ai ricercatori di guardare il cablaggio tra quei neuroni, dice Ed Boyden, un neuroscienziato del Massachusetts Institute of Technology di Cambridge. Così facendo, “si può collegare la struttura del cervello con la sua funzione”, dice. “
Un altro vantaggio dei GEVI è che, a differenza degli elettrodi, che registrano principalmente segnali dal corpo cellulare, possono registrare segnali elettrici da qualsiasi parte di una cellula nervosa, fino alle punte dei dendriti (vedi ‘Colpire la bilancia’). È come essere in grado di ascoltare specificamente le note suonate dalla mano sinistra di un pianista. “Questo è qualcosa che ho sognato per molto tempo – e non sono sola”, dice Katalin Toth, una neurobiologa dell’Università Laval di Quebec City, Canada. Molti neuroscienziati stanno cercando di seguire la tensione attraverso interi neuroni per vedere come cambia in diverse regioni della cellula, dice.
Wei Wei, un neurobiologo dell’Università di Chicago, Illinois, sta usando GEVI per capire come diversi input elettrici sono integrati nei neuroni della retina del topo. Wei è interessato a una classe di neuroni che risponde più fortemente a uno stimolo visivo quando si muove in una particolare direzione. Guardando come la tensione di membrana cambia in diverse parti di questi neuroni, spera di capire come le cellule sommano i segnali in arrivo per rilevare la direzione del movimento.
Il neurofisiologo Vincent Villette dell’Ecole Normale Supérieure di Parigi prevede di usare sensori di tensione per studiare come le fluttuazioni regolari di segnali elettrici sotto soglia determinano il modo in cui i neuroni nel cervelletto del topo coordinano l’attività muscolare. “C’è molto da capire su come le cellule agiscono insieme”, dice Villette.
Avere una lettura visiva della tensione di membrana permette anche agli scienziati di vedere i segnali elettrici che inibiscono l’accensione dei neuroni piuttosto che attivarla. Poiché i segnali inibitori sono impossibili da registrare con approcci come l’imaging del calcio, non è chiaro come esattamente modellano l’attività cerebrale, dice Rosa Cossart, un neurobiologo presso l’Istituto Mediterraneo di Neurobiologia di Marsiglia, Francia.
Cossart ha usato elettrodi e calcium imaging per anni, ma ora è ansiosa di provare i GEVI. Spera che questi sensori le permetteranno di misurare la tensione ad alta velocità attraverso più neuroni – almeno 50 – allo stesso tempo in un topo vivo. Questo aiuterebbe a capire come i gruppi di neuroni integrano i segnali elettrici – sia eccitatori che inibitori – per sostenere attività che sono cruciali per lo sviluppo e la funzione del cervello, dice.
Sfide profonde
Nonostante le grandi aspettative, far funzionare i GEVI in laboratorio può essere una seccatura. Prendete Helen Yang: come studente laureato alla Stanford University della California, ha deciso di provare i GEVI come un modo per studiare i neuroni nel sistema visivo del moscerino della frutta. Ma scrutando attraverso il microscopio durante il suo primo esperimento, Yang non ha visto alcun cambiamento nella fluorescenza delle cellule, nemmeno quando ha fatto lampeggiare una luce brillante negli occhi delle mosche. Solo quando ha analizzato i dati si è resa conto che gli stimoli visivi producevano un segnale, ma solo uno molto piccolo. “Ero piuttosto eccitata, ma i miei compagni di laboratorio lo erano meno”, dice. “Le risposte erano piuttosto piccole e rumorose”
Yang ha iniziato a giocare con le impostazioni del microscopio, aumentando la potenza del laser e accelerando l’imaging. “Fondamentalmente l’ho fatto andare più veloce di quanto il nostro microscopio potesse”, dice. Questo perché la risposta dell’indicatore a un segnale elettrico era così veloce che il cambiamento di fluorescenza era rilevabile solo per una frazione di secondo. “Se stai catturando solo un fotogramma durante il tempo in cui la cellula sta rispondendo, la risposta non sembra affatto grande”, dice Yang.
Yang alla fine è riuscito a usare i GEVI per studiare come i neuroni delle mosche elaborano i segnali visivi5, ma il tipo di sfide che ha affrontato hanno finora impedito all’imaging di tensione di diventare una tecnica mainstream. Richiede piattaforme di microscopio avanzate, spesso costruite su misura, dice Cohen. “Non puoi semplicemente farlo sul microscopio fluorescente di tua nonna”.
Negli ultimi cinque anni, il sostegno finanziario dell’iniziativa BRAIN ha stimolato i progressi nel campo, compreso lo sviluppo di migliori GEVI, dice Michael Lin, un ingegnere delle proteine a Stanford.
In parallelo con lo sviluppo di nuovi sensori, gli scienziati stanno lavorando su tecniche di immagine con precisione i segnali elettrici veloci che viaggiano attraverso il cervello. Una sfida è che la maggior parte delle tecniche disponibili funzionano bene solo con le cellule in un piatto o sulla superficie del cervello. Ma il cervello dei mammiferi non è trasparente: infatti, sembra tofu, dice Na Ji, un fisico dell’Università della California, Berkeley.
Per scrutare più in profondità, i ricercatori devono rivolgersi a metodi più invasivi, come la rimozione di parte del tessuto sovrastante o l’inserimento di piccoli dispositivi ottici chiamati micro-endoscopi direttamente nel cervello. Un modo alternativo e non invasivo per guardare nei tessuti opachi – fino a 1 millimetro di profondità – è la microscopia a due fotoni. Questa tecnica utilizza una luce di lunghezza d’onda più lunga e a bassa energia, che può penetrare più in profondità nei tessuti. Poiché i microscopi a due fotoni illuminano e registrano solo da un singolo punto alla volta, catturano le immagini troppo lentamente per tracciare gran parte delle chiacchiere veloci del cervello. Ma gli specialisti sono fiduciosi che i progressi nella tecnologia renderanno presto possibile vedere i segnali prodotti dai GEVI a velocità più elevata. “È assolutamente fattibile”, dice Ji.
Se i diversi approcci possono superare queste sfide, gli scienziati non hanno dubbi che l’imaging di tensione diventerà un approccio standard per misurare l’attività del cervello. “Nel prossimo anno o due, vedremo un sacco di documenti che hanno applicato sensori di tensione e imparato la biologia”, dice Thomas Clandinin, un neurobiologo di Stanford. Alcuni dicono che la tecnica potrebbe anche sostituire gli elettrodi per questioni relative a come i neuroni elaborano e integrano le informazioni.
I ricercatori alle prime armi sono particolarmente ottimisti: Hochbaum, che ora è un borsista post-dottorato alla Harvard Medical School di Boston, dice che a lungo termine, i GEVI saranno uno strumento per studiare come i diversi compartimenti della cellula rispondono a segnali sotto-soglia. Egli prevede di utilizzare l’imaging di tensione per capire come tali segnali alterano la connessione tra i neuroni, un processo chiave nell’apprendimento. Le possibilità sono eccitanti, dice Hochbaum, ma ha imparato almeno una lezione importante da quei primi giorni di salti in laboratorio per la gioia dopo aver visto un bagliore in un microscopio: quando gli esperimenti funzionano, mantenere le celebrazioni al minimo.