L’obiettivo generale di questo saggio di inibizione dell’emoagglutinazione è di misurare i titoli anticorpali contro virus specifici di interesse. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della vaccinologia sull’immunità e la protezione mediata dal vaccino all’interno di diverse popolazioni e in vari gruppi di età e di pazienti. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è accurata e che permette la rapida determinazione del titolo della presenza di anticorpi neutralizzanti.
Anche se questo metodo può fornire informazioni sui titoli anticorpali umani, può anche essere applicato ad altri sistemi, come i titoli anticorpali per siero di topo, anche supernatanti di coltura. Iniziare etichettando le piastre per microtitolazione a 96 pozzetti con le informazioni sperimentali appropriate. Poi girare la piastra in orientamento verticale e utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 25 microlitri di PBS ad ogni pozzo, tranne il primo pozzo della fila di titolazione posteriore inferiore.
Aggiungere 50 microlitri della soluzione di antigene appena preparato di interesse al primo pozzo della fila di titolazione posteriore, seguita dall’aggiunta di 25 microlitri di campioni di siero trattati RDE ai primi pozzi delle prime dieci righe. Aggiungere 25 microlitri dell’antisiero appropriato al primo pozzetto dell’undicesima fila come controllo positivo. Trasferire 25 microlitri dal primo pozzetto di ogni fila ai loro pozzetti successivi per eseguire diluizioni seriali di due volte.
Pipettare su e giù 10-15 volte per ogni fase di diluizione, scartando gli ultimi 25 microlitri dagli ultimi pozzetti. Successivamente, aggiungere 25 microlitri della soluzione di antigene a ciascun pozzetto delle file da uno a 11 e 25 microlitri di PBS solo a ciascun pozzetto della fila di titolazione posteriore. Battere attentamente la piastra 10 volte su tutti e quattro i lati per mescolare.
Poi coprire la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell’incubazione, aggiungere 50 microlitri di soluzione di globuli rossi ad ogni pozzetto e mescolare la piastra con altri colpetti. Quindi coprire nuovamente la piastra e incubare i globuli rossi in base alla specie utilizzata, come indicato nella tabella.
Dopo aver aggiunto i globuli rossi alla piastra, attenersi al tempo di incubazione appropriato per il tipo di sangue utilizzato nel test. Un’incubazione troppo breve o troppo lunga porterà ad un’errata interpretazione dei risultati. Alla fine dell’incubazione, valutare l’emoagglutinazione inclinando la piastra di 90 gradi per 25 secondi e segnare i risultati per ogni pozzetto, mentre la piastra è ancora inclinata, su uno schema stampato della piastra a 96 pozzetti.
In questo esperimento, la risposta anticorpale indotta dal vaccino è stata valutata in 26 volontari sani che hanno ricevuto un vaccino influenzale trivalente inattivato contenente influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 e B/Massachusetts/O2/2012 prima della stagione influenzale 24 2015. È stata osservata una risposta immunitaria cross-reattiva per i ceppi virali A/H3N2/Switzerland/2013 e A/H3N2/Texas/2012, con titoli di inibizione dell’emoagglutinazione significativamente più bassi e sieroprotezione indotta contro l’influenza A/H3N2/Switzerland/2013 rispetto all’influenza A/H3N2/Texas/2012. Dopo la vaccinazione, i titoli anticorpali contro entrambi i ceppi sono aumentati, anche se il ceppo A/H3N2/Svizzera/2013 non era presente nel vaccino.
L’emoagglutinina virale dimostra un potenziale di emoagglutinazione degli eritrociti dipendente dalla specie. È interessante notare che il sangue di porcellino d’India non emagglutina correttamente con l’influenza B e il sangue di tacchino ha il potenziale per l’emagglutinazione con titoli elevati e una bassa reattività incrociata. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in tre ore se eseguita correttamente.
Mentre si tenta questa procedura è importante ricordarsi di fare il siero con RDE per inattivare qualsiasi inibitore aspecifico e legame aspecifico durante l’emoagglutinazione del virus. Dopo questa procedura, altri metodi come ELISA possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande sul ruolo delle immunoglobuline specifiche dei singoli patogeni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell’immunologia virale per approfondire la nostra comprensione dell’immunità legata al vaccino in pazienti sani e immunosoppressi in diversi gruppi di età.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un test di inibizione dell’emoagglutinazione per quantificare i titoli anticorpali specifici del ceppo influenzale su larga scala. Non dimenticare che lavorare con antigeni virali, sangue animale e campioni di siero umano può essere estremamente pericoloso e che le precauzioni come lavorare in un laboratorio BSL2 dovrebbero sempre essere prese durante l’esecuzione di questa procedura.