アクリルアミドとの共重合と電気泳動による一本鎖DNAの精製

一本鎖DNA（ssDNA）はアプタマー（1）、自己組織化（2）、DNA折り紙（3）、DNA回路（4）、ハイブリダイゼーションプローブ（5）、DNAロボティクス（6）などに有用である。 化学的に合成されたDNAは、デフォルトでは一本鎖である。

ここでは、PCR産物からssDNAを生成する方法を紹介する。 化学合成に比べて変異が少なく、化学合成の限界である約120塩基よりも長いDNAを生成できるため、合成DNAの代わりにPCR産物を使用することは有利であると考えられる。 また、PCR産物は化学合成されたDNAよりも配列純度が高く、クローンからスタートした場合、化学合成されたDNAよりも高い配列純度を持つ。 高い配列純度は、DNA回路技術(7)の高性能化に不可欠です。

私たちの一本鎖生成（SSG）法は拡張性があり、精製工程は一度だけです。 これは、不要な相補鎖を除去し、残留プライマーや不要なPCR産物からサイズに応じた精製を行うものである。 共重合と電気泳動によるSSGは、Gibson assembly (8)のような高度なPCRプロトコルの産物に適用して、任意の配列の長い一本鎖産物を作成することができる。 これは、DNA折り紙や他の自己組織化アプリケーションに利用できるかもしれない。

SSGは、アクリダイトとして知られる市販のDNA修飾を利用するものである。 この修飾は重合可能なビニル基を付加するもので、成長するアクリルアミドポリマー鎖に組み込まれる(9)。 アクリダイト修飾DNAは、スイッチング可能なハイドロゲル（10）、水銀（11）やPDGF（12）の捕捉、特定の配列の電気泳動速度の変更（13）など、多くの用途に用いられてきた。 我々の技術は、Churchグループが薄いポリアクリルアミドゲルの中にポリメラーゼコロニーを固定化した方法と表面的にはよく似ている。 アクリダイトは、ある種のDNA配列決定においてクローン性PCR産物（ポロニー）の形成に重要である(14)。

大量の純ssDNAが必要な場合、アクリダイト修飾プライマーとポリアクリルアミド固定化を用いる我々のアプローチは価値あるオプションである。

材料と方法

特に断らない限り、試薬はSigma Aldrich (St. Louis, MO) から購入し、さらに精製せずに使用した。 DNAはIDT (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) から入手し、さらに精製せずに使用した (配列情報については、補足表S1参照)。

Demonstration of capture of acrydite strand

最初のアクリルアミドとの共重合とその後の電気泳動によるSSGの実証では、一方のプライマーにアクリジッドとCy5赤蛍光色素を修飾したものを使用した。 もう一方のプライマーは、緑色蛍光の5′フルオレセインで修飾して購入した。 図1は、100μlの10%変性ゲル（重合開始前のプレポリマー）と100μlのPCR産物（産物の約20pMol）および適切な質量の乾燥尿素（最終アクリルアミド濃度5%、最終尿素濃度7M）を混合して、DNAサンプルを作成した方法を示している。 DNA/プレポリマーを5%変性PAGEゲルの乾燥したウェルにロードした。 ゲルを後述のように加熱し、電気泳動を行い、緑色蛍光鎖を固定化した赤色蛍光鎖から分離した。 得られたゲルをLED照明付きの標準的なゲルイメージングシステム（FluorChem Imaging System, Protein-Simple, San Jose, CA）を用いて画像化した。

一本鎖の生成と精製（垂直ゲル電気泳動）

PCR はすべての場合において、50 nMのテンプレート、10 μMの各プライマー、8熱サイクルでAccuprime Pfx reaction kit (Life Technologies, Grand Island, NY) で実行された。 PCR産物は100μlの反応で最終濃度7Mになるように固体尿素を加えることで変性させた。 ポリアクリルアミドは、アクリルアミド：ビスアクリルアミドの比率が19：1の水中40％アクリルアミドの市販のストック溶液から調製した（バイオラッド、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）。 変性ポリアクリルアミドは、最終濃度7M尿素、20%アクリルアミド、0.25×TBEバッファーで調製した。 重合は、1μlのTEMED（N，N，N′，N′-テトラメチルエチレンジアミン）および10μlの10％過硫酸アンモニウムを、1mLの変性アクリルアミドプレポリマーのアリコートに加えることにより開始された。 この混合物の一部（重合開始前のプレポリマー）を、7M尿素（10％アクリルアミド、最終濃度）を有する100μl PCR産物（製造者の指示による5つの20μl PCR反応、プールした）と1：1に急速に混合した。 PCR/重合アクリルアミド混合物を標準的な縦型変性PAGEゲルのドライウェルに添加した。 PCR/変性アクリルアミドの完全な重合は、アルゴンまたは99.97%窒素の穏やかな流れでウェルの上の空間をフラッシングすることで確実になった(重合を阻害するあらゆる酸素を置換するため)。 約30分の重合後、電気泳動装置を設置した。 ポリアクリルアミドを破砕し、その浸軟片をウェルにロードすると、非常に幅広く、不規則な形状のバンドが生じたため、このアプローチは断念した（データは示されていない）。 ウェル内での重合は、より優れたアプローチであった。 我々は、マイクロ波でランニングバッファーを沸騰するまで加熱し、ウェルからDNAの放出を促すために、カソードリザーバーに高温（約80℃-90℃）のバッファーを加えた（充填したウェルに高温バッファーを流し込む）。 ゲルリグが電気泳動に必要な容量になるまで、ホットバッファーの添加を継続した。 DNA を含むゲルは、電圧の印加に伴い、ホットバッファに直接接触する。 高温バッファーは速やかに適用し、冷却させないようにする必要がある。 その後、図1に示す図に従って電気泳動を行った。

SB (5 mM ホウ酸ナトリウム)とTBEバッファーをランニングバッファーとして使用することができる。 SBとTBEは、それぞれpH8.42と8.36でRTで調製した。 80℃では、これらのpH値はそれぞれ8.21と7.47に変化する。 このpH変化は一過性である。 電気泳動中にゲルは30℃〜40℃に冷却される。 このpHの変化はDNAの目立った劣化を引き起こさない。

2本の鎖の分離を視覚化するために、2種類の蛍光色素で修飾したプライマーを使用した。 可動鎖はフルオレセインで修飾したプライマーを用いて生成した。 不動鎖のプライマー（アクリダイト）は、内部にCy5修飾を施したものを用意した。 この2つの色素を用いることで、分離の進行状況を可視化することができた。 このゲルを500Vで45分間電気泳動した後、ゲルイメージャー（FluorChem Q, ProteinSimple, Santa Clara, CA）でスキャンした。

別のアプローチとして、PCR産物は標準的なエタノール沈殿であらかじめ濃縮しておくことができる。 このペレットは、より少量のアクリルアミドプレポリマーに溶解させることができる。 この方法では、ウェル内の濃度は沈殿時のロスによって相殺される。

一本鎖のフルオレセイン修飾産物を持つ蛍光バンドを、青色LED照明下で∼475 nmでゲルから切り出した（Bulldog Bio, Portsmouth, NH）。 DNAは標準的な破砕・浸漬法(15)で溶出させた。 溶出した（回収した）DNAが希薄すぎて効率的なエタノール沈殿ができない場合、ブタノールで抽出することで濃縮した。

PAGE analysis

fluorescein labeled single-stranded products (ssDNA released by denaturing PAGE) は、Native PAGEを用いて純度を分析した。 一本鎖生成物を10μlに再懸濁し、UV-Vis分光法で定量した。 プライマーと一本鎖生成物を等モル濃度にし、これらのサンプルと25bpの緑色蛍光ラダー（Jena Bioscience, Jena, Germany）を15%ネイティブPAGEゲルで電気泳動し、ストームスキャナーで蛍光シグナルを視覚化した。

クエンチャー分析

産物が実際に一本鎖であることをさらに立証するために、3′クエンチャー修飾を含む相補的オリゴヌクレオチド（クエンチプローブ）のハイブリダイゼーションについてテストした。 正しくハイブリダイズすると、クエンチプローブは、相補鎖上の5′フルオレセイン修飾の数ナノメートル以内にIowa Blackクエンチャーを配置する。 これにより、蛍光強度が急激に減少する。 クエンチプローブはssDNAにのみハイブリダイズする。 もし、生成物が2本鎖であれば、ハイブリダイゼーションはブロックされ、蛍光は影響を受けない。 100 nMのフルオレセイン修飾産物（PCR産物、SSG産物、プライマーコントロール）の10 μlサンプルをPCRチューブに3連で調製した。 これらをQuantiFluor蛍光光度計（Promega, Madison, WI）で初期蛍光値を測定し、その後1.1モル当量のクエンチプローブDNAを加え、ボルテックス、遠心分離し、約1分間インキュベートさせた。

Comparison of single-strand generation techniques for aptamer production

機能的アプタマーを生成するためのこの方法の有効性を確かめるために、リゾチームに結合する既知のアプタン配列のPCR増幅用テンプレートを購入した。 このテンプレートをフルオレセイン修飾プライマーとアクリダイト修飾リバースプライマーで増幅した。 SSGプロトコルは上記のように実施した。 標準的なEDCカップリングプロトコルで、リゾチームを5.8μmカルボキシレート修飾ビーズ（Bangs Labs, Fishers, IN）に結合させた。 これらのビーズを、SSG生成物、蛍光ランダム化DNA（アプタマーと配列の類似性がない）、および同じ配列の化学合成された蛍光アプタマーとともにインキュベートした。 また、ネガティブコントロールとして、コーティングされていないビーズを化学合成された蛍光アプタマーとインキュベートした。 インキュベーションは30分間行い、その後ビーズを3回洗浄した。 FACScalibur（BD Bioscience San Jose, CA）を用いて、これらの粒子についてフローサイトメトリーを行った。 488nmの光で励起した蛍光強度の分布を記録した。

一本鎖の生成と精製（水平ゲル電気泳動）

7M尿素変性ポリアクリルアミドゲルを先に述べたように水平にキャストした(16)。 簡単に言うと、25mLのプレポリマー溶液（7M尿素、6％アクリルアミド／ビスアクリルアミド、SB緩衝液）を84μl APSと20μl TEMEDで開始した。 ゲルプレポリマーを横型に注いだ。 その後、モールドをプラスチックバッグに入れ、窒素でパージした。 ゲルは30分間重合させた。 フルオレッセイン標識およびアクリダイト標識のDNAをpH8.0の1Mリン酸ナトリウム中で混合し、80℃まで昇温し、毎秒0.1℃でゆっくりと冷却してアニーリングし、RTとした。 このとき、2本鎖間の分子間ハイブリダイゼーションを促進するために、混合物をゆっくり冷却した。 8.4μl APSおよび2μl TEMEDを加えることによって、プレポリマー混合物（2.5mL）を開始させた。 一旦混合すると、この溶液の20μlを5μlのDNA溶液に添加した。 これをポリアクリルアミドゲルの乾燥したウェルに移した。 電場線の歪みを避けるため、残りのウェルは非DNA含有アクリルアミドで満たした。 ロードしたゲルをビニール袋に入れ、窒素でパージした。 ゲルは10V/cmで10分間運転した。 その後、青色LEDトランスイルミネーターとデジタルカメラを用いて画像化した。 ウェル内の架橋ゲルからssDNAを放出するために、25mLのSBバッファーをマイクロウェーブで沸騰するまで加熱した。 この熱いバッファーをゲルの上に注いだ。 電気泳動は10V/cmで10分間継続した。

フルオレセインとアクリダイトで標識されたDNAの最初の結合は、1Mリン酸ナトリウムバッファーを用いて促進された。 もしDNAがハイブリダイゼーションによってのみ結合しているならば、7M尿素と電気泳動中の5mM SBバッファへのバッファの交換は、DNAをゲル中に放出するのに十分である。 その代わり、熱が必要であった。

結果と考察

Acrydite-modified DNA is immobile under electrophoresis

dsDNA PCR産物の二つの鎖のうち、アクリダイト鎖はコポリマーに捕えられ、相補鎖は移動可能であることが示された。 これを実証するために、一方のプライマーをアクリダイトと赤色蛍光色素(Cy5)の両方で修飾してPCRを実施した。 リバースプライマーはフルオレセインで修飾した。 PCR産物は変性PAGEゲル(5%)に重合された。 プロセスの模式図をFigure 1に示す。 当初は、緑色蛍光鎖と赤色蛍光鎖の両方が共局在している（黄色に着色したゲル）。 電圧をかけると、フルオレセイン標識体（緑色）だけがゲル内に移動する。 アクリダイトとCy5で共標識された鎖（赤）は、最終的なゲル画像で固定される（図1B）。 さらに、PCR反応から残ったプライマーが2本目の緑のバンドとしてはっきりと見える。 電気泳動後、純粋な一本鎖生成物は、標準的なゲル精製プロトコルに従って切断し溶出することができる。

Single-stranded DNA verification

目的のバンドを切断し溶出することにより、一本鎖の蛍光色素修飾DNAを単離した。 この方法で回収された産物が一本鎖であることを示すために、2種類の方法を用いた。 第一の方法は、ネイティブゲル分析である。 図2Aは、本法で精製したプライマー、PCR産物（dsDNA）、ssDNAを含むネイティブゲルの画像である。 ネイティブゲルでは、dsDNAとssDNAが明確に分離していることがわかる。 アクリダイトプライマーでSSGした後、ゲルを切断し、生成物を溶出させると、分離されたDNAのほとんどが一本鎖になる

我々は、クエンチャー修飾ハイブリダイゼーションプローブを用いてこの結果を確証した（図2B）。 このプローブは、ssDNA産物上のフルオレセイン部分にクエンチャーを近づけるように設計されている。 ハイブリダイゼーションに伴い、クエンチャー分子は蛍光強度を約90%減少させる。 プローブはssDNAにしか結合しないので、この実験はフルオレセインで修飾された生成物が一本鎖であることを証明するものである。 ネガティブコントロールとして、dsDNAのPCR産物もテストした。

Aptamers synthetic by PCR purified by co-polymerization and electrophoresis

当社のSSG技術により、高純度のssDNAが合成された。 PCRで合成したssDNAアプタマー産物を2つの方法で精製した。 (i)共重合と電気泳動によるSSG法、(ii)他で紹介したビオチン-アビジン固定化法(ポリサイエンステクニカルデータシート753)(17、18)を用いてPCRからssDNAアプタマー産物を精製した。 一本鎖のアプタマーも化学合成で作製した。 図3Aは、3つの異なる方法を用いて生成したssDNAアプタマーを示している。 Lane 1はサイズ比較のためのマーカーラダーである。 レーン2は、アクリダイトプライマーを用いたPCR、アクリルアミドとの共重合、電気泳動、ゲル精製によって生成した精製ssDNAである。 ssDNAとして正しいサイズのバンドが1本だけ見える。 Lane 3は、ビオチン化プライマーを用いたPCRとアビジンコート磁気ビーズによる精製によって生成したssDNAである。 レーン4は同じ配列で化学的に合成されたDNAである。 共重合と電気泳動によりSSGから精製されたssDNAアプタマーは高いssDNA純度を示した

次に、この手順で機能的なアプタマーが生成されるかどうかを検証してみた。 そのために、プライマーを変更したPCRを使用して、リゾチームに対する既知のアプタマーを生成した。 この「クローン1」抗リゾチームアプタマーは、Ellington 研究所で最初に作製され、当初は RNA アプタマーとして選択された (19); 他のグループは、DNA 配列もアプタマーとして作用すると報告している (20,21). 我々は、PCRと化学的DNA合成の両方で、機能的なアプタマーが生成されることを見出した。 これらの実験や他の実験から、これはRNAとその親DNA配列の両方がターゲットに結合する数少ない例外的なケースの一つであると結論づけられる。 ほとんどのアプタマーは、異なる化学物質に直接翻訳されると機能しないのです。 これらの結果は、Clone 1 抗リゾチームアプタマーが特殊なケースであることを示す文献にある多くの事例を裏付けるものである。 図 4B は、ランダム DNA、リゾチームに対する化学合成アプタマー、またはリゾチームに対する当社の SSG 精製アプタマーにさらされたリゾチームコーティングビーズを示したものです。 SSG精製アプタマーと化学合成アプタマーは共にリゾチームコートビーズに強い結合を示したが、ランダムDNAはリゾチームビーズに有意な結合を示さなかった。 このことは、これらの相互作用がアプタマー配列に特異的であることを示している。 コーティングされていないビーズはアプタマーの有無にかかわらず蛍光を示さず、結合がタンパク質に特異的であることを示している。

Heating releases DNA from wells

SSG 法を用いてPCR 産物からssDNA アプタマーを精製する場合、DNA の電気泳動を容易にするためにゲルを加熱しなければならなかった（「材料と方法」参照のこと）。 この必要性を理解するために、我々は水平PAGEを用いた。 熱を加えることなく、7M尿素と電圧勾配を使用したにもかかわらず、目的のssDNA PCR産物はウェル内に保持された。

我々の最初の仮説は、この保持がPCR産物の80bpの混成に起因しているということであった。 この仮説を検証するために、フルオレッセインで標識したClone 1 aptamer DNA（図4ではF-Aptamerと表記）を23ヌクレオチド長のアクリジッド修飾プライマー（図4ではAC-Clone1-P2と表記）にアニールして相補性を23 bpに減らし、共重合と電気泳動によるSSGを実施した。 比較的短い23bpのハイブリダイゼーションにもかかわらず、かなりの量のアプタマーDNAがウェル内に保持されていた（図4A、下段）。 これは、7 M尿素で容易に変性するはずの23 bpという短いハイブリダイゼーションストレッチが、ウェルから目的のssDNA鎖を放出することができなかったため、我々の仮説が間違っていたことを示していた。 ここで、5′-アクリダイト修飾された19ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド(図4でAC-DNAと表記)を、19ヌクレオチドの完全相補的でフルオレッセイン標識されたオリゴヌクレオチド(図4でF-DNA*と表記)にアニールさせた。 ハイブリダイゼーションの長さが似ているにもかかわらず、短いDNAは熱を加えることなく、変性ゲル中でその相補体から容易に精製された。 19ヌクレオチドでフルオレッセイン標識された移動鎖のほぼすべてがゲルに入る（図4A、中央のレーン）。 アクリダイトで修飾した19-merが保持されていることを示すために、フルオレセインとアクリダイトの両方で修飾した鎖（図4ではAC-DNA-Fと表記）もウェルに共重合し（上のレーン）、うまく保持された。 (配列および命名の詳細については、「材料および方法」および「補足表S1」を参照)

最初の20分間の電気泳動(加熱なし)の後、クローン1アプタマーDNAの多くが(短い交配長にもかかわらず)移動しないことは明らかであった。 ポリアクリルアミドからアプタマーDNAを遊離させるためには、ゲルを加熱することが必要であった。 我々は、電子レンジでランニングバッファーを沸騰寸前まで加熱し、ウェルの領域でゲル上に注いだ。 その後、さらに20分間電気泳動を続けたところ（図4B、下のレーン）、アプタマーのバンドが移動するようになった。 この新しいバンドは、最初に移動したバンドと同じ移動度を有しており、これが同じアプタマー種であることが示された。 同様に、これは図3Aで単一のバンドしか得られなかったDNAのサンプルと同じものであった。 この実験は、ポリアクリルアミドからすべての長いssDNAを放出するために、ゲルを加熱する必要があることを示している。

Horizontal PAGE for single-strand generation and integrated electroelution

水平ゲルの使用により、生成バンドを切断して抽出するのではなく、電気泳動を行うことができる。 水平PAGEで電気溶出と抽出のためのウェルを追加するために2番目の抽出コームを使用することで、SSGとDNAの電気溶出をより迅速に行うことができるようになった。 我々は、Inkscape ソフトウェアを使用して、ローディングコームよりも深くて広い電気溶出用の別のコームを設計した（コームの切断に使用したテンプレートは補足資料を参照）。 デザインはCO2レーザーカッターでアクリルをレーザーカットした（図5のAおよびBを参照）

通常、PAGEはガラス板間の垂直ゲルを使用して実施される。 横型のPAGEゲルをキャストするためには、重合中に酸素を排除する必要があった。 そこで、窒素ガス（またはアルゴンガス）を充填した袋の中で重合を行い、酸素を排除した。 図5Cは、共重合によるSSGの水平ゲルと電気泳動による電気泳動である。 レーン1〜4（上から）にはアプタマープールが含まれる。 レーン5は、不注意なクロスコンタミネーションを避けるために空のままであった；レーン6のプライマー標準は、望ましくないバンドを区別するために存在した。 このプールは、アクリダイト修飾プライマーとフルオレセイン標識プライマーを用いて増幅された。 アクリダイト修飾プライマーは、ウェルに保持された。 フルオレセインで標識された生成物は、青色LED照明下ではっきりと見える。 プライマーを抽出ウェルに通し、ゲルの反対側へ出した（図5D参照）。 生成物のバンドが抽出ウェルに近づいていく様子を、青色光トランシルミネーターでリアルタイムに観察することができた。 生成物のバンドがウェルに入ったら、ピペットで吸引した。 その後、アプタマー選択プロトコルに沿って、沈殿と回収を行った。

dsDNAからssDNAを分離する方法はいくつかある。 PCR産物からssDNAを精製する方法としては、誘導移動度シフト（22）、ビオチン-アビジンビーズ固定化（18）、DNaseによる選択的消化（23）、PCRプライマーの非対称付加（24）などがある。 これらの方法は、コスト、純度、スケーラビリティにおいて様々である。 一方のプライマーに誘導移動度シフト（22）が生じると増幅に問題が生じ（例えば、PEG修飾プライマーはPCRでのパフォーマンスが低下する）、DNaseによる酵素消化（23）や一方の鎖の化学切断は不純物を残す（また、プロセス全体に別のステップを導入する）ことになる。 PCRプライマーの非対称付加(24)は、生成物中にかなりの量のdsDNAを残し、増幅エラーが発生しやすくなる。 最も一般的な方法は、アビジンコートしたマイクロスフィアを用いて、不要なビオチン化鎖を抽出する方法である(18)。 この方法にはいくつかの落とし穴がある。 未反応のプライマーがビーズ上のアビジン部位を占め、ビオチン-アビジン相互作用が長い二本鎖DNAの融解温度で分解してしまうのである(25)。 このため、dsDNAの不純物が多くなる。 ビーズを使用する方法は、大きなコストがかかる。 アビジンビーズが$1.80/nMol、ビオチンプライマーが$0.50/nMolである。 共重合と電気泳動によるSSGでは、アクリダイトプライマーだけが必要であり、そのコストは$0.80/nMolである。 ポリアクリルアミドは非常に安価で拡張性がある。 電気泳動移動度は、この技術に固有の精製の第二の次元である。

我々は、SSGが機能的なアプタマーを精製するために使用できることを示した。 この技術はまた、DNAアプタマー選択の過程でssDNAプールを精製するために使用される可能性がある。 さらに、SSGはアフィニティープローブやDNA折り紙のバックボーン用のssDNAの生成にも応用できるかもしれない(3)。 化学合成と比較して、PCRによるDNA生成は配列の忠実度が非常に高く、DNA計算/DNA回路などの応用に極めて重要であることに注目したい(26)。

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