この凝集阻害アッセイの全体目標は、関心のある特定のウイルスに対する抗体価を測定することです。 この方法は、さまざまな集団内、さまざまな年齢層、患者層におけるワクチンによる免疫と防御について、ワクチン学分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。 この方法の主な利点は、正確であることと、中和抗体の存在を迅速に測定できることです。
この方法はヒトの抗体価に関する洞察を提供しますが、マウス血清や培養上清の抗体価など、他のシステムにも適用することが可能です。 96ウェルマイクロタイタープレートに適切な実験情報をラベル付けするところから始めます。 その後、プレートを垂直方向に回転させ、マルチチャンネルピペットを使用して、25マイクロリットルのPBSを、一番下の逆滴定列の最初のウェルを除くすべてのウェルに加えます。
逆滴定列の最初のウェルに新しく準備した目的の抗原溶液50マイクロリットルを加え、続いて25マイクロリットルのRDE処理血清サンプルを上位10列の最初のウェルに加え、さらにその最初のウェルに25マイクロリットルのPBSを加えます。 ポジティブコントロールとして、11列目の最初のウェルに25マイクロリットルの適切な抗血清を添加する。 各列の最初のウェルから25マイクロリットルを連続したウェルに移し、連続した2倍希釈を行います。 次に、1～11列目の各ウェルに25マイクロリットルの抗原液を、後ろの滴定列の各ウェルに25マイクロリットルのPBSのみを添加します。 プレートを四方から10回ほど注意深く叩いて混ぜます。
その後、プレートに蓋をして室温で30分ほど放置します。 培養終了後、各ウェルに50μlの赤血球溶液を加え、さらにプレートを叩いて混和します。 赤血球を加えた後は、使用する血液の種類に応じた適切なインキュベーション時間を守ってください。 インキュベーションが短すぎたり長すぎたりすると、結果の解釈は正しくありません。 インキュベーション終了後、プレートを 90 度傾けて 25 秒間、赤血球凝集を評価し、プレートを傾けたまま各ウェルの結果を 96 ウエルプレートの印刷図にマークしてください。
この実験では、2015年インフルエンザシーズン24日前に、インフルエンザA/H1N1/カリフォルニア/2009、A/H3N2/テキサス/2012、B/マサチューセッツ/O2/2012を含む不活化3価インフルエンザワクチンの投与を受けた26人の健康なボランティアにおいて、ワクチン誘発抗体反応を評価しました。 A/H3N2/Switzerland/2013およびA/H3N2/Texas/2012ウイルス株に対する交差反応性免疫応答が認められ、インフルエンザA/H3N2/Switzerland/2013に対する幾何平均血球凝集阻止力価および誘導血清保護はインフルエンザA/H3N2/Texas/2012と比較して有意に低いことが確認されました。 ワクチン接種後、A/H3N2/Switzerland/2013株がワクチンに含まれていないにもかかわらず、両株に対する抗体価は上昇した。
ウイルスヘマグルチニンは、赤血球凝集能に種依存性を示すことが明らかになった。 モルモットの血液はB型インフルエンザの赤血球凝集を起こさず、七面鳥の血液は高い力価と低い交差反応性で赤血球凝集を起こす可能性があることは興味深い。 この方法をマスターすれば、適切に行えば3時間以内に完了します。
この方法を試す際には、ウイルスの血餅化の際に非特異的阻害物質や非特異的結合を不活性化するためにRDEで血清を作ることを覚えておくことが重要です。 この手順の後、ELISAなどの他の方法を用いて、個々の病原体特異的免疫グロブリンの役割に関する追加の質問に答えることができる。
このビデオを見た後は、インフルエンザ株特異的抗体価を大規模に定量化するための赤血球凝集阻害アッセイの実施方法についてよく理解できたことでしょう。 ウイルス抗原、動物の血液、ヒトの血清サンプルを扱うことは非常に危険であり、この手順を実行する際にはBSL2実験室での作業などの予防措置が常に必要であることを忘れないでください。