変性BRもネイティブBRもGroELに結合できる
GroEL活性メカニズムの中心は、主に基質の疎水性残基とGroEL先端ドメインのヘリックスHおよびIとの相互作用を通じて多様なポリペプチドを認識する能力です（図1A）（Coyle et al.1997, p. 1.参照）。 そこで、変性BRとネイティブBRのGroELへの結合を、まず等温滴定熱量測定（ITC）により調べた。 図2Aに示すように、GroELとBRの滴定では、いずれの場合も発熱性の滴定熱量が得られた。 シャペロニンを含まないアッセイバッファーにBRを連続注入すると、平坦なサーモグラムが得られることから、この熱変化はBRとGroELの結合によるものと考えられる（補図S1）。 図2Aに示した各注入の熱を積分し、希釈熱で補正し、BR: GroELのモル比に対してプロットした(図2B)。 熱の変化は1セットの部位結合モデル（赤と青の曲線）に適合し、解離定数（Kd）は変性BRで0.3 nmol/L付近、ネイティブBRで6.0 nmol/L付近をそれぞれ得た（表1）。 このように、BRの変性により、GroELとこの膜タンパク質との結合親和性は1桁増加した。 一方、いずれのBR試料も結合は有利なエンタルピー変化（ΔH）により駆動され、負のエントロピー変化（ΔS）により対抗する。どちらの場合にも決定された結合化学量論（N）はユニットに近い（Table 1）。 しかしながら、ネイティブなBRの結合は、より少ないエントロピー補償で明らかにエンタルピーが低い。
ITCによって評価したGroELへのBR結合。 A GroELとSDS変性BR（dBR、赤）またはネイティブBR（nBR、青）の滴定。 サーモグラムはMicroCal ITC200装置で20℃で記録した。 B A の各注入の熱交換を積分し、BR:GroEL のモル比に対してプロットした。 実線は単一部位モデル（すべての部位が同一で等価）へのデータの適合を表し、得られた熱力学パラメータを表1
蓋形のコ・シャペロニン・GroESはバクテリアにおいてGroEL媒介タンパク質折り畳みに必須の構成要素である。 であり、GroEL上の基質と同じ結合部位を共有していることが示されている（Chen and Sigler 1999）。 GroESの存在下でGroELを変性BRで滴定すると、GroESはBRの結合にほとんど影響を与えないことがわかった（補足図S2、表1）。 この結果は、GroEL/ES 複合体形成のための Kd が 3 μmol/L であり、今回決定した BR-GroEL 複合体のそれよりも著しく高いことを考慮すると理解できる (Behlke et al. 1997)。 このことは、2つのシャペロニン蛋白質の相互作用がはるかに弱いことを示し、それ故に、重要でない効果とも一致する。 しかし、in vivo で GroEL と GroES の結合と放出のサイクルを制御している ATP の存在下では、 GroEL/ES の親和性は 3 桁上昇し（通常 Kd ~1 nmol/L） (Farr et al. 2000) 、理論上 GroEL への BR 結合と競合することが可能であった。 その後、BRのフォールディングに対するapoGroELの効果、そしてこのプロセスにおけるGroESとATPの役割について調べた。
GroEL-GroES system can modulate BR folding in presence of DDM
SDS変性したBRの一部を可溶化洗剤n-dodecyl-β-D-maltoside（DDM）過剰で薄めると再成長することが、網膜吸収回復測定により明らかになった（補足図S3）（Booth 1997）。 洗剤のないアッセイバッファーやGroELのみを補充したアッセイバッファーでは、有意な回復は検出されなかった。 しかし、DDMの存在下では、GroELの添加はBRのフォールディングに明らかな効果を示した（補足図S3）。 GroEL（0.15μmol/L）を介したフォールディングの速度定数は、単一指数速度論でフィッティングした結果、自発的なフォールディングの2倍程度と推定された。 GroELは、その非存在下では効率的にフォールディングできる可溶性タンパク質のフォールディングを通常遅らせることが知られている。 これは、分子内のフォールディングとGroELへの分子間結合の間の競争によって説明されてきた（Gray and Fersht 1993; Itzhaki et al 1995）。 GroELが変性したBRのリフォールディングにおいても同様の挙動を示すことは、十分にあり得ると思われる。 GroELの濃度を0.30 μmol/Lに上げても、推定速度定数は明らかに変化しなかったが、フォールディングの収量は60分後に自発的フォールディングよりはるかに高いレベルに達した（補足図S3）。 これらのデータは、apoGroELはBRのフォールディング速度を低下させるが、フォールディングされたタンパク質の収率を向上させることができることを示している。
細菌は数ミリモルのATPを含み、通常の条件ではGroESとGroELの相対モル比は1.9、熱ショック後は4.7（Moparthiら2013）なので、GroELはATPおよびGroESに結合しなければ長く滞在できない可能性があった。 ATP存在下（図3Aの青）では、apoGroEL単独や自発的な過程（図3Aの赤と黒）と比較して、正しく折りたたまれたBRの回復が著しく速く、大きくなった。 一方、GroEL と GroES の組み合わせでは、自発的な折りたたみの速度にはほとんど影響を与えなかったが、収量はある程度減少した（図 3A、シアン）。 これは、GroEL と GroES の間に ATP を必要としない相互作用があり、おそらく GroEL に結合した BR によって誘導され、その結果、正しく折りたたまれたタンパク質の回復に悪影響を及ぼしたことを示している。 完全なシャペロニン系を用いた場合（図3A、緑）、最大の速度向上が観察されたが、折りたたみ収量は先の2つのケースの間に落ちた。
ATP 依存性の GroEL-GroES システムにより調節を受けた BR 折りたたみのタイム コース。 A折りたたまれたBRの回復を554nmの吸光度を用いて連続的にモニターした。 以下の添加を行った：なし（黒）；0.3 μmol/L GroEL（red）；0.3 μmol/L GroEL および 5 mmol/L ATP（blue）；0.3 μmol/L GroEL および 0.6 μmol/L GroES（cyan）；0.3 μmol/L GroEL, 0.6 μmol/L GroES および 5 mmol/L ATP（green）. B 正味の GroEL を介した BR フォールディングをまず行い、T = 60 分後に、試料に ATP のみ、GroES のみ、または両方を示したように添加した。 C A との比較のために、BR フォールディングに対する非サイクルシングルリング（SR1） バージョンの GroEL の効果も分析した。 SR1、GroES、ATP の濃度は、それぞれ 0.6 μmol/L、1.2 μmol/L、5 mmol/L であった。 D 560 nm の吸光度変化を追跡することにより、BR のネイティブフォールドに対する GroEL/ES + ATP の効果を調べた。 B と D で使用したシャペロニンおよびヌクレオチドの濃度は A と同じである。すべての実験において、BR は 2.4 μmol/L に保たれた。 Aの青線と緑線、Cの青線はデータを三相指数式にフィットさせたものであり、残りの線は単指数式にフィットさせたものである。 BとDの線はすべて目の単純な目安である
以上の結果から、ATPとGroESは異なる方法でGroELを介したBRフォールディングに影響を与えることができることが示された。 GroESのGroELへの結合は、GroEL/ESケージにおける基質のカプセル化がフォールディングの補助にプラスの役割を果たすことがよく知られているのとは対照的に、フォールディングにいくらか不利な影響を与える（Jewett and Shea 2010）。 次に、この悪影響がどのようにして生じるのかを調べた。 興味深いことに、GroES単独、あるいはGroESがGroELに結合する可動ループ配列も、フォールディングしたBRの回復を促進した（補足図S4）。 さらに、ループ配列は、ATP非存在下および存在下において、GroELを介したフォールディングにおいて、GroESと同様の効果を示した（補足図S4）。 しかし、GroESのようにGroELの中心空洞の上に密閉されたキャップを形成することはできず、ループ-GroEL相互作用がフォールディングに大きく寄与していることが示唆された。 注目すべきは、GroESの可動ループとの結合に関与するGroEL先端表面の疎水性残基は、基質タンパク質との結合に関与する残基とほとんど重なっていることである（Motojima et al.2000）。 特に、ケージの外側にDDMミセルが存在し、BRのフォールディングや可溶化をさらに促進することを考えると、疎水性のBRが移動ループによって親水性のGroEL/ESケージに変位して解放されたとは考えにくい。 好ましくは、いくつかの可溶性タンパク質のフォールディングの補助について実証されたように（Motojima and Yoshida 2010）、この研究でシステム全体あるいはGroEL/ESだけを使用した場合、BRはGroEL/ES界面の近くで捕捉され、一部が外側にはみ出るかもしれない。 しかし、ATPとGroESの役割は、粘着性のある基質（すなわち、今回決定したKdがnmol/L領域）を解離させることのみであり、この基質が除去されないと、フォールディング速度が制限されたり、GroELのフォールディング活性が阻害されることさえあるとする研究もある (Priya et al. 2013)． GroESとATPがBRのフォールディングを補助する際に同様の効果を示すかどうかを調べるために、まずapoGroELを変性したBRと60分間インキュベートし、その後、GroELまたは/およびATPを加えた（Fig.3B）。 その後、GroELまたはATPを添加すると、BRのフォールディングがさらに促進されたが、両者を同時に添加した場合よりも効果は小さく、GroELを介したフォールディングの補助における両者の相乗効果が実証された。 変性 BR の模倣品として、変性 BR と GroEL-BR 相互作用の動的な性質がもたらす複雑さを回避するために BR の膜貫通ペプチドを用いた異方性測定から、ATP と GroES の組み合わせのみが、形成前のペプチド-GroEL 複合体を効率的に分離できることがわかった（補 足図 S5）。 そこで、GroELを介したBRのフォールディングに対するGroESとATPの影響をさらに検討するために、循環するGroEL-GroES系とは対照的に、GroESと安定な複合体を形成する単環GroEL変異体（SR1）を用いた（Weissman et al. GroELを用いた場合と同様に、ATPはSR1を介したフォールディングの速度と収率を増加させたが（図3Cの青）、GroESの存在により、apoSR1単独の場合または自然なプロセス（赤または黒）と比較して、両方の面が大幅に低下した（シアン）。 変性BRはITCによってSR1とユニティーに近い化学量論で結合すると決定され（補足図S2）、使用したSR1はGroELの2倍の濃度であったことから、BR-GroELよりもBR-SR1複合体が多く形成し、それによってGroESがよりフォールディングに影響を与えたと推察された（シアン色）。 予想通り、ATPとGroESの両方を添加してもBRの回収率（緑）には影響がなかった。これは、ATPの存在下でGroESがSR1に不可逆的に結合したためと考えられる（Weissman et al 1995）。 さらに、この結果は、GroELで観察された最大の速度向上が、ATPによって制御されたGroESの結合と解放の複数サイクルによることを示している。
GroEL単独あるいはATPまたはGroESとの組み合わせは、DDMで可溶化したネイティブBRの構造に対してほとんど影響を示さず（図3D）、ネイティブタンパク質内で分子間結合よりも強い分子内相互作用を示すGroELと結びついていることが示唆された。 シャペロニンを介したBRの準安定な変性状態からネイティブ状態への移行は、熱力学的に有利である。 可溶化剤であるDDMが存在しない場合、SDS変性BRは蛍光相関分光法（FCS）により、GroELに結合した状態（～104μm2/s）よりもはるかに低い拡散係数（～67μm2/s）を持つと推定された（Fig.4）。 このことは、変性したBRが形成する凝集体は、ITCによって決定された結合化学量論がユニットに近いBR-GroEL複合体よりもさらに大きいことを反映している。 このことは、GroELが凝集構造を破壊し、単量体BRとの生産的な折りたたみ経路を本質的にポンピングできたことも意味している。 さらに、DDMで可溶化したnBRは、拡散係数が〜117μm2/sと決定され、これはGroELを用いたdBRよりも大きく、dBR単独の場合よりもはるかに大きい（Fig.4）。 このことは、nBRがDDMの存在下でよく分散していたことを示唆し、またGroELを介したdBRの解離の考えを支持する。 さらに、変性したBRに完全なシャペロニン系を添加すると、白色の凝集沈殿が直ちに確認された（データなし）。これは、強制的なアンフォールディングと、この点でのGroESとATPの相乗効果を示している。 また、DDMの存在下で観察されたフォールディング速度の大幅な上昇とは対照的に、バルク溶液中に可溶性の洗剤や生体膜を模倣する脂質がなければ、アンフォールドしたBRは瞬時に凝集して沈殿する。
図4
GroEL-GroES 系によるIMVへのBR挿入の仲介。 A 変性BR（2.4μmol/L）のIMVへの挿入及び／又はリフォールディングを、554nmの吸光度を用いて連続的にモニターした。 以下の添加を行った：なし（黒）；0.3 μmol/L GroEL （赤）；0.3 μmol/L GroEL および 5 mmol/L ATP （青）；0.3 μmol/L GroEL および 0.6 μmol/L GroES （シアン）； 0.3 μmol/L GroEL, 0.6 μmol/L GroES および 5 mmol/L ATP（グリーン）。 B Native BRは、GroELの存在下、ATPとGroESの助けを借りて、IMVに効率的に転移させることができる。 試験したネイティブBR、GroEL、GroES、およびATPの濃度は、それぞれ0.4、5、10μmol/L、および5mmol/Lであった
次に、蛍光異方性は、BRのIMVへの挿入に対するバクテリアシャペロニンの効果を調べるために用いられた(Fig. 5B)。 蛍光標識したネイティブBRを過剰量のGroELと混合すると、異方性はより高い値にシフトし、膜タンパク質がシャペロニンと安定な複合体を形成していることが示された。 重要なことは、その後 IMV を加えると異方性がさらに上昇し、BR が IMV に統合されたことが示されたことである。 ATPとGroESはBRの膜への移行をさらに促進することが、異方性の増加によっても判断された。 これらの結果から、GroELはGroESやATPとともに、生体内のタンパク質の脂質二重層への統合に直接関与している可能性が示唆された
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