蛋白質130と131の14-3-3としての同定、特性、検証
図1. 
図1. 二次元電気泳動後のタンパク質スポット130および131を示す銀染色ゲルの領域。
パネルAは正常な脳脊髄液で、スポット130と131は存在しない。 パネルBはクロイツフェルト・ヤコブ病の患者からの脳脊髄液で、矢印はスポット130と131を指している。 パネルCとDのゲルは、正常なヒトの脳から抽出したものである。 パネルA、B、Cは同じゲル領域で、等電点4.8〜6.0（左から右）、サイズ10〜40kd（下から上）をX軸にとったものである。 パネルCの点線枠は、パネルDのpH4.5〜5.4のゲルから得た領域の輪郭を示す。 パネルBとCの矢印は、パネルDでラベルされたスポット130と131の位置を示す。
クロイツフェルト・ヤコブ病患者の脳脊髄液タンパク質130と131を検出するための二次元電気泳動の結果を、図1Aと図1Bに示す。 近年の技術改良により解像度が向上し、当初記載されていた2つのスポット（タンパク質130と131に対応）ではなく、6つのスポットを持つようになった。 これらのタンパク質の豊富な供給源を見つけるために、正常な脳組織を調べて、脳脊髄液タンパク質130と131に対応するスポット群の近くに、脳タンパク質があるかどうかを調べました。 図1Cは、正常な脳タンパク質の二次元電気泳動後の銀染色ゲルの領域である。 いくつかのタンパク質は130-131星座と同じ領域に現れ、その中には脳脊髄液の130-131星座と同じ電荷と質量を持つものが2つ含まれている。 この2つのスポットの位置に基づく同定は、comigration研究によって確認された。 図1Dに示すように、スポット130は狭域二次元電気泳動(pH range, 4.5 to 5.4)で精製した。
スポット130は10ブロットから切り出し、酵素消化し、マイクロシーケンスを行った。 アミノ酸配列は4つのペプチドフラグメントから得られた。 これらの配列のうち、Val-Thr-Glu-Leu-Asn-Glu-Pro-Leu-Xaa-Asn-Glu-Asp-Xaa-Asn-Leu-Ser-Val-Ala, Asp-Tyr-Tyr-Xaa-Tyr-Leu-Ala-Glu-Ala-Thr-Gly-Glu-Lys, and Asn-Val-Val-Xaa-Ala-Arg-Ser-Xaa-Arg-Val-Ile-Ser-Ser-Ile-Glu-Gln はヒト 14-3-3 タンパク質のアイソフォームエタ の配列と一致するものであった。 第4の配列、Tyr-Ser-Glu-Ala-Xaa-Glu-Ile-Serは、ウシ14-3-3タンパク質、アイソフォームγの配列と一致した。
14-3-3抗体は二次元電気泳動免疫ブロットで脳脊髄液タンパク質130および131と特異的に反応したが、他の脳脊髄液タンパク質とは反応しなかったので、脳脊髄液タンパク質130および131が14-3-3タンパク質であることが確認できた
14-3-3 Immunoassay
図2. 
図2. ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミド-ゲル電気泳動後の抗14-3-3βポリクローナルウサギ抗体の免疫染色。
レーン1はアルツハイマー病の病理学的証拠を有する患者からの脳脊髄液、レーン2および3はクロイツフェルト・ヤコブ病の2人の患者からの脳脊髄液、レーン4は正常牛からの脳脊髄液、レーン5は実験的に誘発した伝達性ミンク脳症および海綿状疾患の病理学的証拠を有する牛からの脳脊髄液である。 レーン6は正常ヒト血清、レーン7はクロイツフェルト・ヤコブ病患者の血清、レーン8は正常ヒト脳の抽出物、レーン9はクロイツフェルト・ヤコブ病患者の脳から精製したプリオンタンパク質を示しています。
脳脊髄液30-kdスポット（タンパク質130と131）が14-3-3タンパク質であることを発見し、伝達性海綿状脳症の診断に役立つ簡易免疫測定法を開発することになった。 図2が示すように、クロイツフェルト・ヤコブ病患者の脳脊髄液では、30-kdの免疫反応バンド（レーン2、3）が検出されたが、健常対照者（データなし）やアルツハイマー病患者の脳脊髄液（レーン1）ではそのようなバンドは検出されなかった。 予想通り、14-3-3は正常ヒト脳の抽出液に豊富に含まれていた（レーン8）。14-3-3タンパク質は正常血清（レーン6）には検出されなかったが、クロイツフェルト・ヤコブ病患者の血清（レーン7）にも検出されなかった。 クロイツフェルト・ヤコブ病患者の脳から精製したプリオンタンパク質（レーン9）は14-3-3抗体と交差反応せず、14-3-3はプリオンタンパク質ではないことが確認された
表1. 
表1. 14-3-3イムノアッセイで評価した脳脊髄液サンプル（診断別）。 表2. 
表2. クロイツフェルト・ヤコブ病に対する14-3-3免疫測定法の感度と特異度。
クロイツフェルト・ヤコブ病患者の脳脊髄液71検体中68検体（96％）が14-3-3陽性であった（表1、表2）。 認知症を伴う他の疾患の患者からの94検体中4検体（4％）が14-3-3に陽性であった（表1および表2）（P<0.001）。 さらに、検査前1ヶ月以内に急性脳梗塞を起こしたことが分かっている認知症患者を分析から除外すると、91検体中1検体（1％）だけが陽性であった（P<0.001）。 多発性梗塞性認知症で検査前1カ月に脳卒中がなかった患者10人の検体はすべて14-3-3が陰性であった。 その他の認知症患者からの脳脊髄液サンプルのうち、1つの偽陽性結果は、病理学的研究によって検証されていないアルツハイマー病の臨床診断を受けた患者からのものだった。
14-3-3 は、認知症を伴わないその他の神経学的疾患を持つ患者からの66の脳脊髄液サンプル中18（27％）で検出された。 この18検体は、急性ウイルス性脳炎、検査前1ヶ月以内の脳卒中（認知症を伴わない）、くも膜下出血、Rett症候群の患者からのものであった。
クロイツフェルト・ヤコブ病のマーカーとしての14-3-3イムノアッセイの感度は96%（真陽性68件、真陽性および偽陰性71件；95%信頼区間、92～99%）で、特異度は88%（真陰性164件、真陽性および偽陽性186件；95%信頼区間、84～92%）であった。 さらに重要なことは、認知症患者全員における本測定法の特異度は96％（真の陰性90件、真の陰性と偽陽性の94件；95％信頼区間、90〜96％）であり、認知症と検査前1カ月以内の脳梗塞患者3人を除くと、免疫測定法の特異度は99％（真の陰性90件、真の陰性と偽陽性91件；95％信頼区間、97〜100％）でした（表1、表2）。
二次元電気泳動法とイムノアッセイの比較
表3. 
表3. タンパク質130と131の二次元電気泳動と14-3-3イムノアッセイの比較。
脳脊髄液50検体について、タンパク質130と131の二次元電気泳動法と14-3-3イムノアッセイを比較した（Table 3）。 クロイツフェルト・ヤコブ病患者15検体のうち13検体が両検体とも陽性で，他の2検体は蛋白質130，131は陰性であったが，14-3-3蛋白質は陽性であった． クロイツフェルト・ヤコブ病や他の神経疾患に関連しない認知症患者の検体でも、両検査の結果は同じであった。 2つの検査の特異度はほぼ同じですが、14-3-3イムノアッセイの方がわずかに感度が高くなっています。
14-3-3 Immunoassay in Animals
Table 4. 
表4. 動物からの脳脊髄液サンプルにおける14-3-3イムノアッセイの結果。
動物における研究の結果は、ヒトにおける研究の結果と一致した。 図2は、正常な牛（レーン4）および伝達性海綿状脳症の病理学的証拠を有する牛（レーン5）の脳脊髄液におけるアッセイ結果を示すものである。 表4に示すように、実験的に伝達性ミンク脳症またはスクレイピーを発症した9頭の牛のうち6頭の脳脊髄液から14-3-3タンパク質が検出された。 臨床的特徴はあるが伝達性海綿状脳症の病理学的証拠を持たない1頭の牛も陽性であった。 対照牛で陽性のものはなかった。 自然発症のスクレイピーを持つ羊6頭中5頭で陽性、対照の羊1頭で陰性であった。 実験的に感染させたチンパンジー15匹はすべて陽性であったが、対照のチンパンジー77匹は1匹も陽性でなかった。 動物における14-3-3イムノアッセイの総合感度は87％、総合特異度は99％であった
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