哺乳類細胞およびトランスジェニックマウスにおけるタグ付き転写因子の効率的なビオチン化と一段階精製

このシステムの試験でタグ付けしたタンパク質は、必須のマウス造血転写因子GATA-1（レビューについては、文献25を参照）であった。 このタグをGATA-1にN末端に融合し、ヒトβ-グロビン発現カセットの制御下で、末端赤血球分化を誘導できるMEL細胞で発現させた（22）。 BirAもヒトグロビン発現カセットを用いてクローニングし、MEL細胞で発現させた。 タグ付きGATA-1およびBirAの一重および二重安定トランスフェクタントに相当するクローンを単離し、両コンストラクトの発現について初期スクリーニングを行った。 GATA-1の場合、GATA-1抗体を用いたウェスタンブロット分析により、トランスフェクト細胞からの核抽出物において内在性GATA-1と同様に移動速度の遅いタグ付きタンパク質が検出された（図1B、レーン1および2）。 BirAの発現をRNAレベルで分析した（データは示さず）。

次に、選択した安定なトランスフェクタントについて、タグ付きGATA-1タンパク質がBirAによってビオチン化されるか否かを試験した。 ストレプトアビジン-HRP結合体を用いてMEL細胞クローンの核抽出物をアッセイすると、タグ付きGATA-1タンパク質に対応する強固なシグナルが示されたが、タグ付きGATA-1/BirAダブルトランスフェクタントのレーンでのみ検出された（図1B、レーン5）。 BirA非存在下では、タグ付きGATA-1のビオチン化は見られない（Fig. 1B, lane 6）。 これらの結果から、BirAタンパク質はトランスフェクトされたMEL細胞において活性型に合成されていることが確認された。 また、BirAのみを発現するMEL細胞核抽出液では、非特異的なバックグラウンドのビオチン化はほとんど観察されない（図1B、レーン7）。 そこで、MEL細胞に細菌BirAタンパク質-ビオチンリガーゼを発現させると、ユニークなペプチドタグを持つ哺乳類転写因子を特異的にビオチン化できると結論した

次に、粗核抽出液中のタグ付きGATA-1をストレプトアビジン常磁性ダイナビーズに結合させてビオチン化の効率を検証した（図1C）。 ビーズから溶出した物質を分析すると、タグ付きGATA-1タンパク質のほぼすべてが結合していた（レーン2とレーン1および3とを比較、図1C）。 同じフィルターをストレプトアビジン-HRPで再処理すると、ビーズによるタグ付きGATA-1のビオチン化および捕捉において≈100%の効率を示した（図1C、レーン4と5）。 さらに、図1Bで見られたことと一致するが、ストレプトアビジン-HRPで検出されるように、内因性のビオチン化タンパク質のビーズへの結合はほとんどバックグラウンドではない（図1C, レーン5)。 これらのデータは、ストレプトアビジン結合により、タグ付きGATA-1が非常に効率的にビオチン化され、抽出物から回収され、バックグラウンドのビオチン化はごくわずかであることを示している

Single-Step Purification of Biotinylated GATA-1 from Crude Nuclear Extracts by Streptavidin Binding. また、粗核抽出物からビオチン化GATA-1を単離する際、適度なストリンジェンシー（150 mM NaCl/0.3% Nonidet P-40/200 ng/μl chicken serum albumin）下でストレプトアビジンビーズに直接結合し、一段階精製の可能性を検討した。 まず、BirAのみを発現するMEL細胞からの粗核抽出物5 mgからのコントロール結合を試みた（図2、レーン4）。 溶出された物質は、より淡いバンドを背景に、強く染色された約5本のバンドから構成されていた（図2、レーン5）。 このレーン全体をゲルから切り出し、液体クロマトグラフィー-タンデムMSで分析することにより、バックグラウンド結合タンパク質を同定した。 こうして同定されたタンパク質は、Gene Ontology Consortium (www.geneontology.org) が定義する生物学的機能および細胞区画に従って表1に分類されている。 その結果、最も多く同定されたバックグラウンドタンパク質は、天然のビオチン化カルボキシラーゼとその関連酵素であり、これらは強く染色されたバンドとほぼ一致した。 また、スプライシングファクターなどmRNAの処理に関与する豊富な核タンパク質や、リボソームタンパク質のバックグラウンド結合も確認された。 これらの3種類のタンパク質を合わせると、使用した条件下ではバックグラウンド結合の>80%を占めた（表1）。 また、転写制御に関与する因子に対応するペプチドはほとんど同定されなかったことは注目に値する（表1）。 ストレプトアビジンビーズへのバックグラウンド結合は、主に内在性のビオチン化タンパク質、およびmRNAのプロセシングやリボソームの合成・組み立てに関わる豊富な核内因子によるもので、転写調節/活性化に関わる因子の非特異的結合はほとんどないと結論した

(A) ビオチン化GATA-1をストレプトアビジンビーズに結合させると、FOG-1抗体を用いたウェスタンブロッティングにより検出されるように、FOG-1が特異的にプルダウンされる。 一方、BirAのみをビオチン化した核抽出液では、FOG-1はストレプトアビジンによりプルダウンされない（右）。 FOG-1はダブレットとして検出される(26)。 (B) ビオチン化 GATA-1 (左) または BirA のみ (右) を発現させた MEL 細胞から得られたクロスリンクしたクロマチンからβmaj グロービン プロモーター配列のストレプトアビジンによるプルダウン。 三角形は、βmaj配列の増幅を検出するためのPCR反応において鋳型として用いたプルダウンされたクロスリンクチロマーチンの量の増加を示す。 βmaj配列に対する特異的な濃縮は、ビオチン化GATA-1を発現する細胞からのプルダウンクロマチンで観察されるが、BirAのみを発現する細胞からは観察されない＜6259＞＜674＞＜1280＞トランスジェニックマウスにおけるビオチン化タギング。 粗抽出物からビオチンタグ化タンパク質を一段階で直接単離できることから、マウス組織のような限定的なソースからタグ付きタンパク質の精製にこの方法を使用できる見通しが立った。 そこで、BirAを介したビオチン化タグ付けがトランスジェニックマウスのin vivoでも機能するかどうかを検証した。 GATA-1 の過剰発現はマウスの胚性致死を引き起こすので (28)、必須赤血球生成転写因子 EKLF をタグ付けしてこの方法を試した (29)。 マウス EKLF cDNA にビオチン化タグとダブルヘマグルチニンエピトープを付与し、マウス卵にマイクロインジェクションしてトランスジェニックマウス系統を樹立した。 同様に、BirA/erythroid発現カセットコンストラクトをマイクロインジェクションしてトランスジェニックマウス系統も樹立した。 タグ付き EKLF と BirA が赤血球で検出可能な発現をするトランスジェニックマウス系統を選択し、交配した。 タグ付き EKLF の in vivo ビオチン化を、生後 13.5 日の胎仔肝臓から調製した核抽出液で評価した。 抗 EKLF 抗体を用いたウェスタンブロット分析では、内因性 EKLF とタグ付き EKLF が検出され、ダブレットとして可視化された (Fig. 4, lane 1)。 胎児肝核抽出物をストレプトアビジンビーズに結合させると、doubletのトップバンドのみが保持され、ビオチン化されていることが示唆された（図4、レーン2および3）。 この観察は、同じブロットをストレプトアビジン-HRPでプローブすることにより確認され、単一バンドのみが検出された（図4、レーン7と9）。 EKLF抗体によって検出されたダブレットは、N末端に融合したビオチン化タグ（上のバンド）と、すぐ下流に存在する二重ヘマグルチニンエピトープ（これも開始コドンを含む）において、翻訳開始コドンが異なって利用されたためと思われる（下のバンド）。 その結果、ビオチン化タグを持つトップバンドのみがBirAの基質となり、このアプローチのin vivoでの特異性がさらに実証された。 核抽出液のストレプトアビジンビーズへの結合からも、トランスジェニックマウスの胎児肝臓では、タグ付きEKLFのかなりの割合（≒50%）がビオチン化されることが示された。 我々は、トランスフェクト細胞と胎児肝臓の間のビオチン化効率の差は（異なる融合タンパク質の使用とは別に）、ビオチンの利用可能性における生体内の制限（ビオチンは細胞培養液の補充に使用するFCSに豊富に含まれている）またはBirA発現レベルの差を反映していると推測している。 これらの結果は、細菌のBirAによるタグ付きEKLFの特異的なビオチン化が、トランスジェニックマウスのin vivoでも高い効率で達成できることを示している