INTRODUCTION
ビタミンC（アスコルビン酸）は不安、記憶、疲労、気分状態の研究に関与する抗酸化物質である。 ヒトを含む一部の動物は、L-グルロノラクトンオキシダーゼという酵素を欠くために、アスコルビン酸を合成できない（Naidu, 2003）。 多くの研究が、ビタミンCがストレスの多い状況によって引き起こされる不安な行動や心理に関係していることを示している。 高用量のビタミンC（1.000mgを1日3回）を14日間投与すると、血圧が低下し、コルチゾールが低下し、急性心理ストレスに伴う主観的反応が減少しました（Brodyら、2002年）。 ビタミンCの血漿濃度レベルは、横断的研究において収縮期および拡張期血圧と逆相関することが判明しています（Nessら、1997年；Batesら、1998年）。 Mazloomら（2013）は、2種類の抗酸化物質（ビタミンCとE）が2型糖尿病患者の不安、うつ、ストレスに与える影響を評価しました。 ビタミンC群は、ビタミンEおよびプラセボと比較して、不安スコアの有意な低下を示したが、うつ病スコアまたはストレスについては群間で有意差は認められなかった＜7549＞＜3373＞さらに最近、Abrawiら（2014）が行った別の臨床研究では、うつ病治療としてのビタミンCの効果および抗うつ薬、例えばパロキセチン、フロキセチン、クロミプラミン、フルボキサミンおよびオランザピンおよびクロミプラミン併用との関連作用が調査された。 著者らは、ビタミンCと抗うつ剤の併用は、うつ病の治療効果をより高めると結論づけた。 同様に、Amrら（2013）も、小児患者における大うつ病性障害の治療の補助薬として、フルオキセチンにビタミンCを加えることの有効性を実証しています。 さらに、うつ病の動物モデルの多くの研究で、ビタミンCの抗うつ効果が示されています（Binfareら、2009；Morettiら、2011、2012a、b、2013、2014）。
ビタミンCの補給は、ヒトにおける疲労の治療に対して一貫した結果をもたらしません。 しかし、Suhら（2012）が実施した臨床試験では、肯定的な結果が得られています。 ビタミンCの静脈内投与は、オフィスワーカーの疲労を2時間で減少させ、疲労レベルは1日低く保たれたのです。 また、実験条件の労働者は、プラセボ群と比較して、血漿中のビタミンC濃度が高く、酸化ストレスが減少していることが示された。 この研究の労働者にとって、ビタミンCの補給は、疲労を軽減する安全で効果的な方法であることが証明されました。 さらに、急性期病院における低ビタミンCおよび低Dの高い有病率が研究により示されています。 ビタミンCの投与は、入院患者の気分を改善し、苦痛を軽減します（Evans-Oldersら、2010；Wangら、2013；Zhangら、2011）。
不安は、未知の、あいまいな、または生理的シグナルを変えることができる内部の脅威に対する反応です（Gautamら、2012）。 したがって、不安は典型的に適応的な機能を果たし、潜在的な危険に対して個人を準備させ、差し迫った脅威に対して人に警告を発する(Gautam et al., 2012; Weinberger, 2001)。 しかし、不安が極めて高く持続する場合、病的となり、障害の基準を満たすことがある(Weinberger, 2001)。 多くの人にとって、不安は、自信の欠如や、学生の場合は学業困難などの二次的な問題とも関連します（Guney et al.） さらに、学生にとっては、パニック、試験に落ちることへの恐怖、緊張して課題を達成できない感じ、心拍の乱れなど、他の症状が教室で表れ、学業成績の低下の一因となることがあります（Vitasari et al.、2011）。 高いレベルの不安は、学生のワーキングメモリーを損ない、注意力を散漫にさせます（Aronen et al.、2005年、Cassady and Johnson、2002年）。 他の研究では、学期末試験中に不安レベルが上昇した学生は、低い点数を取得する傾向があることが示されている（Hamzah, 2007）。 不安は学生の学業成績の主な予測因子であり(McCraty, 2007)、不安レベルの上昇は学業成績の低下と関連し得る(Mazzone et al., 2007; Sena et al., 2007)。
酸化ストレスは不安障害の病態生理に貢献し得る(Guney et al., 2014; Ranjana et al., 2012)。 Presentは、小児および青年における総オキシダント／抗酸化物質レベルと不安障害の間に関連性があることを示した（Guneyら、2014）。 このことは、不安障害を持つ小児および青年において、酸化ストレスが有害である可能性を示唆している。 この意味で、脳で起こる高い酸素消費量と脂質の多い体質（Halliwell, 2006; Ng et al., 2008）は酸化ストレスに寄与し、これが精神疾患を促進または誘発する可能性があります（Bouayed et al.） 遺伝学、神経化学、神経生物学、心理学などの他の要因の中で、酸化ストレスは不安障害の病因の重要な要因であると考えられる（Guneyら、2014年）。 他の研究では、酸化ストレスと強迫性障害（OCD）およびパニック障害（PD）との関連も見出されており、酸化代謝が不安の調節に影響を与えることがさらに示されています（Kulogluら、2002a, b）。 このような神経化学的変化に対抗するために、生体システムには抗酸化防御が備わっている。 したがって、抗酸化物質の補給は、不安に苦しむ個人の酸化ストレスと戦うために重要な治療的役割を果たすかもしれません (Gautam et al., 2012)。
この研究の目的は、ビタミンCのような重要な抗酸化物質が高校生に抗不安様作用を及ぼすかどうかを評価することでした。 生徒の不安レベルは、不安に関連する人間の認知行動に対するビタミンCの潜在的な治療的役割を調査することができるBeck Anxiety Inventoryとして知られる検証済みの機器によって評価された。 ブラジル連邦区Ceilândiaの男女の高校生に本研究への参加を呼びかけた。 参加者全員に研究の詳細を説明し、インフォームドコンセントを示す用紙に署名してもらった。 実験プロトコルと不安の評価はヘルシンキ宣言とGCPガイドに準拠し、ブラジリア大学保健科学部ヒト研究に関する倫理委員会（番号：022/12.
）の承認を得ている。 健康状態が良好な学生を対象とした。 参加者に喫煙歴はなかった。 妊娠中、ビタミンCサプリメントや処方薬を常用している場合、制限された薬を常用している場合（精神科患者）、または、精神疾患、糖尿病、高血圧、心臓疾患、肺、腎臓疾患の素因、栄養不良に関する状態（くる病、年齢に対して低体重、精神問題）を含む病歴がある学生は除外された。 42名の学生を募集し、ビタミンCまたはプラセボのいずれかを投与するよう無作為に割り付けた（各群n = 21）。 脱落者はいなかった。 参加者はプラセボカプセルまたはビタミンCサプリメント500mgカプセルを14日間毎日摂取した。 カプセルの組成は、カプセルの監視と配布を担当する栄養士のみが知っていた。 学生たちは、生化学、栄養学、心理学、神経科学の専門家からなる学際的なチームによって評価された。 このチームは、すべての学生に対して面接を行った。 学生には、試験の目的と手順を説明した。 実験初日は、朝8時に学生を実験室に迎え入れ、栄養士からプラセボまたはビタミンCカプセルの入ったキットを受け取ることから始まった。 ビタミンCとプラセボのカプセルは、Pharmacy Medicines, Brasilia, Distrito Federal, Brazil (Pharmacotechniques)から入手したものである。 プラセボカプセルはビタミンCカプセルと外観が同じであった（どちらも緑と白の色）。 次に、収縮期・拡張期血圧と心拍数を測定し、血液サンプルを採取した（5 mL）。 採血には8時間の絶食が必要であること、採血開始は午前9時であることを全生徒に伝えてあった。 手順は、ブラジル連邦区保健局の勧告に基づき、連邦区中央公衆衛生研究所（LACEN-DF）のスタッフによって行われた。 採血は午前10時に終了し、すべてのサンプルは分析のためにLACEN-DFに転送される準備が整いました。 採血後、生徒とチームには朝食が提供されました。 その後、生徒たちはチーム心理学者によって、不安に関する神経心理学的テストであるBAIを無作為の順番で評価された。 1日目のこれらのテストがベースライン測定となった。 これらの実験手順は、補給後の15日目（ポストトリートメント）に繰り返された
血圧測定。 血液サンプルを採取する前に、学生の収縮期、拡張期血圧と心拍数を自動自己膨張式携帯血圧計（Powerpack MS-918）を用いて記録した。 この手順は15日目（治療後）にも繰り返された。
血液サンプルと実験手順。 血漿アスコルビン酸濃度は、当初、ジケトグロン酸およびデヒドロアスコルビン酸によるアスコルビン酸の酸化を基準としていた。 これらの生成物は2,4-ジニトロフェニルヒドラジンと反応して2,4-ジニトロフェニルヒドラゾンを形成する。 この化合物は硫酸（H2SO4）と反応した後、520 nmで測定できる吸収帯を持つ生成物を形成する。 本研究では、血漿中のアスコルビン酸濃度をBessey（1960）が提案したプロトコルに従い、先行研究（Marimら、2012；Garlipp-Picchiら、2013）と同様の方法で評価した。 すべての学生から皮下注射針を用いて静脈血サンプルを採取した（5 mL）。 2,4-dinitrophenylhydrazine (2%), thiourea (5%), and copper sulfate (0.6%), DTCを含む100 mL溶液を調製した。 この直後に0.4 mLの試料（血清）を取り出し、1.6 mLの5%トリクロロ酢酸（TCA）混合液に30秒間加え、2.500 rpmで10分間遠心分離した。 その後、上清0.6 mLにDTC試薬0.2 mLを加え、その後30秒間振盪した。 この操作を3回繰り返した。 標準溶液を完成させるため、65% H2SO4 1 mL を加え、30秒間振盪した。 30分後、遮光して、分光光度計（SpectraMax M5, Molecular Devices）で520 nmの波長を読み取った。 血漿中のアスコルビン酸濃度は検量線を用いて算出した。
不安行動テスト。 Beck Anxiety Inventory (BAI) は1986年にBeck, Brown, Steer and Epsteinによって考案された(Beck et al., 1988; Cunha, 2001)。 21の項目は、不安に特徴的な身体的、感情的、認知的な症状を反映するように設計された。 この目録は、うつ病の症状との混同を避けるために作られたものである。 スコアが8から15の間は軽度の不安、16から25の間は中等度の不安、25から63の間は重度の不安と解釈される。
統計的分析 本実験の数値構築には、プログラムソフト「Graph Pad Prism」を使用した。 統計解析は、IBM SPSS version 20.0 for Windows (IBM Corp. NY, USA)を用いて行った。 データはMeans±Standard Deviation (SD)として表した。 変数分布の正規性を評価するために、Kolmogorov-Smirnov 検定を実施した。 結果が正規分布であった場合、群間の差はパラメトリックなStudents t-testsを用いて評価された。 正規分布でない場合は、ノンパラメトリックのWilcoxon signed-rank 検定とMann-Whitney U 検定が用いられた。 カテゴリー変数については、カイ二乗検定を用いた。 有意水準はp<0.05とした。
RESULTS
学生の人口統計学的特徴を表1にまとめた。 ビタミンC群の平均年齢は30.43±14.35歳、プラセボ対照群の平均年齢は24.24±11.07歳であった。 学生によるt検定では、ビタミンC群とプラセボ対照群の間に差はなかった（p = 0.125）。 また、性別による差もなかった（p = 1.000）。 身長、体重、ボディマス指数（BMI）の評価では、ビタミンC群とプラセボ群の間に有意差は見られなかった。つまり、記述的特徴に関して、2群は互いに差がなかった。
不安、血漿ビタミンC濃度、収縮期血圧、拡張期血圧、心拍数の平均点は、ベースラインと実験介入後（治療後）ともに表2に示す通りであった。 Wilcoxon signed-rank検定により、ベースライン治療と比較して、治療後のビタミンC群では有意な減少が見られた（p = 0.010）。 Fig.1に示すように、介入後の不安スコアはプラセボ対照群よりもビタミンC群で有意に低く（p = 0.010）、ビタミンCの経口サプリメントが学生の不安レベルを改善することが示されました。 介入期間後の血漿ビタミンC濃度は、ビタミンC群がプラセボ群よりも高かった（p = 0.001）。
| 表1： | 研究参加者の人口統計学的特性(1) グループ（n = 21） |
| 表2: | 不安スコアのベースラインと治療後のビタミンC補給またはプラセボ、生化学的および生理学的パラメータまたはプロファイル（1） |
| BAI.BAI: Beck anxiety inventory, PCVC: Plasma concentrations of vitamin C, SBP: Systolic blood pressure, DBP: Diastolic blood pressure, HR: Heart rate, Post, refers to 14-day treatment, 1All values are Means±SDS, 2Wilcoxon signed-rank test | |
| Fig.2.の通り。 1: | BAIで評価した不安に対するビタミンCまたはプラセボの効果、ビタミンC（n = 21）およびプラセボ（n = 21）群における学生の不安得点の箱ひげ図。 両群のBAIで評価したベースラインと治療後の不安感。 (p = 0.010）は、Wilcoxons signed-rank testを用いて算出された。 Post、14日間の治療後を指す |
同様に、ビタミンC群の平均心拍数はプラセボ対照群と比較して有意差があった（p＝0.032）。 しかし、平均収縮期血圧（p＝0.933）と拡張期血圧（p＝0.698）では、ビタミンC群とプラセボ群の間に治療前も治療後も有意差は見られませんでした。 これらの結果は、ビタミンC実験群がプラセボ対照群と比較して、平均心拍数のみで、より良い生理学的反応を持っていたことを示唆している、ビタミンCは不安症状に関与しているこのパラメータを改善したことを示します。 一般に、学生は安食症であると考えられていた。 食事（p＝0.569）、食品（p＝0.807）、飲料（p＝0.816）については、ビタミンC群とプラセボ群の間に差はなく、栄養面との関係で同質であることが示された＜7549＞＜3373＞DISCUSSION＜7549＞＜3373＞本研究では、高校生の不安に対するビタミンC経口補給の効果について評価した。 ビタミンCはBAI不安スコアの低下によって示されるように、抗不安様作用を示した。 さらに，ビタミンCはプラセボと比較して心拍数も低下させた。 これらの結果は、2型糖尿病患者を対象に、6週間のビタミンC（1.000 mg/日）とビタミンE（400 IU/日）の補給が、不安レベル、うつ病、ストレスに及ぼす影響を調べた先行研究とも一致するものである。 その結果、ビタミンCは、ビタミンEおよびプラセボと比較して、不安スコアを有意に減少させることがわかりました。 一方、ビタミンEは不安のスコアを有意に増加させました。 同様に、この研究では、ビタミンCはプラセボ群に比べ、ストレスレベルを有意に減少させることがわかりました。 この意味で、ビタミンCは神経系の障害を引き起こしていた脳内の酸化的損傷を軽減することで、糖尿病患者の不安レベルを改善していたのです（Mazloom et al.、2013）。
この検索から見つかったデータは、不安を軽減し工学部の学生の学力を改善するためにデザインされた介入の効果を調べた別の研究（Vitasari et al.、2011）において収束しています。 この研究では、不安を測定するために1分間あたりの呼吸数（bpm）が用いられた。 各生徒は2時間のセッションを6回受け、呼吸法、リラクゼーション、対処スキルの勉強からなる治療を受けた。 その結果、すべての参加者が不安を軽減し、その結果、おそらく学業成績が向上したことが示されました。 したがって、このスタイルの介入は、学生の不安を軽減するための効果的なアプローチであると考えられた。 これらの結果を総合すると、ビタミンCの経口補給は、高校生の不安レベルを低下させ、学業成績を向上させる可能性があることが示唆される。 同様に、ビタミンCは不安の補助治療となる可能性がある。
不安とうつは一般的な、ストレスによって誘発される精神疾患である（Gautam et al.） ビタミンCの欠乏は、うつ病の症状を誘発する可能性があります。 アスコルビン酸の低レベルは、高齢者における抑うつ症状および死亡率の上昇と関連している（Hamerら、2011）。 さらに、Amrら（2013）は、ビタミンCがうつ病の治療に対するフルオキセチンの効果を改善することを示し、大うつ病性障害と診断された小児患者において実質的な副作用がないことから、魅力的な治療補助剤とみなすことができるとした。 著者らは、うつ病の治療に対するビタミンCの有効性と抗うつ薬の治療補助としての作用を評価するために、より大規模な臨床試験の必要性を強調した（Amrら、2013）。 疫学的研究により、早期に発症した不安障害が、後年発生するうつ病やその他の気分障害の発症の誘因として寄与することが示されています（Beesdoら、2007年、Duffyら、2013年）。 同様に、不安障害および気分障害は、酸化経路に関与する病原性メカニズムと関連している（Guneyら、2014）。 これらの著者のために、ビタミンCの補充は、抑うつ症状、疲労および気分状態に対する効果と同様のメカニズムで、不安を軽減し、生化学的および行動の変化をもたらす抗酸化剤として作用することができる。 したがって、ここで収集したデータは、これらの仮説をサポートしています。
栄養の面では、ストレス状況を正常化するためにエネルギーの生産を発生し、炭水化物、タンパク質、脂肪の代謝を加速するビタミンやミネラルの副腎生産と動員の増加などのストレス状態で体に追加の需要があります（Gautamら、2012年）。 ストレス反応や不安障害に関与し、情動反応に関与する視床下部-下垂体-副腎（HPA）軸の機能を変化させる異常があります（Masoodら、2008年；Mathewら、2008年）。 例えば、慢性的なストレスへの曝露は、酸化的な損傷を誘発し、HPA軸を活性化することが示されています（Aschbacherら、2013年）。 また、別の研究では、不安レベルが高いと酸化ストレスが有意に増加することが分かっています（Rammal et al.、2008）。 さらに、酸化ストレスとは、フリーラジカルが過剰に生成され、抗酸化防御機構が機能しなくなることです（McCord, 1993）。 抗酸化物質の不足は、タンパク質、脂質、糖質、DNA、ミトコンドリアに損傷を与える、反応性が高く毒性のある活性酸素種（ROS）および活性窒素種（RNS）からの保護を低下させます（Maes et al.、2011；Sindhi et al.、2013）。 抗酸化物質は活性酸素の影響を中和し、いくつかの疾患を予防する作用を発揮します(Sindhi et al., 2013)。 これらの著者らは、抗酸化物質の補充は、不安レベルの予防または低減のための新しい戦略であるかもしれないが、不安障害を有する個人が抗酸化物質を欠乏している可能性があり、酸化ストレスの増加が示唆されることも示唆している＜7549＞＜3373＞本研究の結果、介入後、ビタミンCグループはプラセボグループと比較して心拍数が減少したことが示された。 神経伝達物質であるγ-アミノ酪酸（GABA）は、心血管系の調節に関与しています。 GABA作動薬の脳室内投与は動脈血圧と心拍数を低下させ、ビタミンCは3H-GABA結合を刺激する (Grigorev and Neokesariiskii, 1986)。 別の研究では、室傍核にグルタミン酸をマイクロインジェクションすると、血圧と心拍数が上昇することがわかった。 N-Methyl-D-Aspatate（NMDA）受容体拮抗薬DL-2-amino-5-phosphonovaleric acid（AP-5）はこれらの反応をブロックした（Liら、2006年）。 一方、心拍数の上昇によって示される高レベルの外傷性不安は、カテコールアミン放出を増加させる引き金となる（Abrawiら、2014）。 アスコルビン酸は、カテコールアミン作動性活性を調節し、ストレス反応を減少させることができる（Aburawi et al.、2014）。 この仮説は、いくつかの知見に基づいています。 アスコルビン酸は、カテコールアミンの調節を通じてNA+/K+-ATPaseの調節因子として記述されています。 また、中枢神経系における神経伝達物質のターンオーバーに作用し（Wigluszら、1983）、OCDをビタミンCで治療した研究（Jormら、2004）により実証されている。 同様に、ビタミンCは、GABA結合を刺激し、NMDAゲートチャネル機能をブロックするか（Rebec and Pierce, 1994）、ドーパミン神経系およびグルタミン酸系を活性化することによって作用するか（Abrawi et al, 2014）、不安を軽減しストレスを緩和する可能性がある。 不安レベルの低下は、カテコールアミンの放出の減少を示す心拍数の低下と関連することができる。
Brunoら（2012）は、高血圧患者の筋肉の交感神経活性と心臓の交感神経バランスに対する急性ビタミンC投与の効果を調査し、ビタミンCは高血圧患者の心血管アドレナリン駆動を減らすことができたことから、酸化ストレスが高血圧における交感神経活性化に寄与する可能性があることを示しています。 したがって、この研究は、抗酸化物質が心拍数の迷走神経制御を回復させることができる可能性を示唆している。 さらに、ビタミンCの大量摂取は、収縮期および拡張期血圧、急性の対人心理的ストレス要因に対する主観的ストレスおよび不安反応を軽減し、ストレス後、ビタミンCは唾液コルチゾールの迅速な回復を促進することが示されている（Brodyら、2002年）。 しかし、本研究の参加者は高血圧の既往がないにもかかわらず、ビタミンC群とプラセボ群の血圧（収縮期および拡張期）に有意な差があるとは言えないという結果が出た。 ビタミンCは高血圧患者において血圧を有意に低下させたが、正常血圧者では低下させなかった（Bruno et al, 2012）の結果と類似しており、ビタミンCは正常血圧の高校生に投与されたためです。
さらに、今回示されたデータは、血漿ビタミンCレベルがビタミンC群（平均1.55-2.65mg dL〜1）で有意に増加し、プラセボ群（平均1.36-1.40mg dL〜1）ではなくなっているというブロディら（2002）の結果に沿ったものです。 さらに、ビタミンCの投与により血漿中のビタミンC濃度が上昇し、ビタミンCの欠乏が心理的異常に関与していることが示唆された（Chang et al.） さらに、別の研究では、ビタミンCを500mg/日〜1日の用量で8週間補給すると、血漿中のビタミンC濃度が約50％増加すること（Khassaf et al, 2003）や、成人におけるビタミンCの平均半減期が約10〜20日（Naidu, 2003）であることが判明しています。 したがって、これらの結果は今回の研究と同様である（表2）。
今後の研究では、不安や他の神経精神障害の患者における血清酸化ストレスパラメータの変化を評価し、これらの症状の治療におけるビタミンC補給、酸化ストレスおよび抗酸化物質の関係を調査するためにさらなる研究を行う必要がある。 ビタミンCなどの栄養素の補充摂取は、長期間にわたって食習慣に影響を与えると考えられ、その効果の強さは、健康、気分、幸福を促進する頻度や程度の違い、また個人の不安レベルの制御によって調節される。
CONCLUSION
この研究は、ビタミンCが不安に対して重要な治療的役割を果たすという証拠を追加するだけでなく、予防と不安レベルの低減における抗酸化物質の使用可能性を指摘するものです。 著者らは、抗酸化物質であるビタミンCなどの微量栄養素を豊富に含む健康食品を含む栄養プログラムを高校で実施することを推奨している。また、不安の補助治療として、また学生の学力向上のためにビタミンCを使用することを推奨している。 結論として、本研究は、ビタミンCを豊富に含む食事が、不安な学生の不安レベルを下げ、学業成績を向上させる可能性があることを示唆している。
ACKNOWLEDGMENTS
著者らは、心理学者および栄養士に感謝したい。 また，この研究に学際的に取り組んでくれたLACEN-DFの全スタッフに感謝したい。