水素-重水素交換

水素交換の父は、Kaj Ulrik Linderstrøm-Langによって密度勾配管を使って測定されました。 現代では、主に次のような方法で水素交換をモニターしている。 NMR分光法、質量分析法、中性子結晶学などである。

NMR spectroscopyEdit

水素原子核と重水素原子核は磁気的性質が大きく異なっている。 したがって、NMR分光法で両者を区別することが可能である。 重水素は1H NMRスペクトルで観測されず、逆に陽子は2H NMRスペクトルで観測されない。 重水素化度の高い試料の1H NMRスペクトルで小さな信号が観測される場合、これを残留信号と呼びます。 これを利用して、分子内の重水素化度を計算することができます。 2H NMRは1H分析に比べ感度が低いため、同様のシグナルは観測されない。 重水素は通常、類似のプロトンと非常に似た化学シフトを示す。 水素（1/2）と重水素（1）の異なるスピン値により、異なる分割倍率が生じますので、13C NMR分光法による分析も可能です。 NMR分光法は、分子の部位特異的な重水素化を決定するために使用することができる。 一般にHSQCスペクトルは、水素が重水素と交換されている間に、一連のタイムポイントで記録される。 HSQC実験は水素に特化しているので、信号は水素が交換するにつれて指数関数的に減衰する。 そこで、指数関数をデータにフィットさせ、交換定数を得ることができます。 この方法は、タンパク質中のすべての残基について、同時に残基固有の情報を得ることができる。主な欠点は、問題のタンパク質のスペクトルを事前に割り当てる必要があることである。 これは非常に手間のかかることで、通常、この方法は25kDaより小さいタンパク質に限定される。

Mass spectrometryEdit

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometryは、H/D交換を行った分子全体の重水素含有量を測定することができます。 サンプル調製が必要なため、通常、非交換水素原子のみの正確な測定が可能であると考えられています。 また、イオン化の前に気相または溶液相で水素/非水素交換を行うこともできます。 重水素は、陽子だけでなく中性子も含んでいるため、水素の2倍の重さを持っています。 したがって、重水素を含む分子は、すべて水素を含む分子よりも重くなります。 タンパク質の重水素化が進むと、それに応じて分子量も大きくなります。 重水素化に伴うタンパク質の質量変化を検出することは、1991年にKattaとChaitによって初めて報告された現代のタンパク質質量分析によって可能になりました。 例えば、ペプチド骨格に沿った重水素交換の位置と相対量は、交換反応がクエンチされた後、タンパク質をタンパク質分解にかけることでおおよそ決定することができます。 次に、個々のペプチドを分析し、各ペプチドフラグメントの全体的な重水素化を確認する。 この手法では、重水素交換の分解能は、消化中に生成するペプチドの大きさによって決まります。 タンパク質分解反応中はクエンチpHを維持する必要があるため、タンパク質分解には酸性プロテアーゼであるペプシンが一般的に使用される。 逆交換を最小限に抑えるため、タンパク質分解とその後の質量分析計による分析はできるだけ短時間で行う必要がある。 逆流を抑えるために、消化物のHPLC分離はエレクトロスプレー質量分析の直前に低温で行われることが多い。

1999年に、重水素化ペプチドの衝突誘起解離(CID)フラグメンテーションとタンデム質量分析を組み合わせて、1残基分離を達成することが可能かもしれないと提案されました。 しかしすぐに、CIDはペプチド内の重水素位置の「スクランブル」を引き起こすことが判明しました。 しかし、MALDI の in-source decay (ISD), electron capture dissociation (ECD) および electron transfer dissociation (ETD) によるフラグメンテーションは、正しい実験条件下ではほとんどスクランブルを生じることなく進行します。 同位体標識のスクランブルは、イオン解離前の衝突加熱により発生し、CIDでもスクランブルは発生しますが、イオン化やイオン輸送の際にも衝突加熱が発生することがあります。 しかし、イオン加熱を引き起こす装置パラメータを慎重に最適化することで、水素スクランブルを最小限に抑え、スクランブルの発生しない手法でフラグメンテーションを行うまで溶液相の同位体ラベルを保持することが可能です。 最近では、ペプチドやタンパク質内の重水素を局在化させるフラグメンテーション技術として、紫外線光解離 (UVPD) も検討されています。 この点については、ある条件下ではスクランブルの起きていないUVPDフラグメントを得ることが可能である一方、UVPDフラグメント化ステップ自体でペプチドとタンパク質の両方にスクランブルが起きることを示すものもあり、結論はまちまちであった。 これらの矛盾を解決するための現在の理論は、ペプチドやタンパク質に紫外線を照射したときに生じる2つの断片化経路、すなわち、直接解離と統計的解離に関係している。 すなわち、実験条件が直接解離に有利で、フラグメンテーションの前後で前駆体イオンを低い内部エネルギーに保った場合、得られるフラグメントの重水素レベルはスクランブルされていない前駆体に対応することになる。 しかし、実験条件によっては、特に照射時間が長く、ガス圧が低い場合、紫外線照射中に統計的解離が起こり、紫外線光子によってもたらされる電子励起エネルギーが内部転換されることがある。 その結果、照射された分子が振動励起され、スクランブルが発生する。

中性子結晶構造解析

高速交換種（水酸基など）の水素-重水素交換は、中性子結晶構造解析によって定量的に原子分解能で測定でき、回折実験中に交換が行われればリアルタイムで測定することが可能です。 中性子はX線と同様に結晶を回折させ、構造決定に利用することができる。 生体内では電子数が1個から0個の水素原子はX線の回折が悪く、通常の実験条件下では実質的に見えない。 中性子は原子核から散乱するので、水素や重水素原子を検出することができる。

水素原子は日常的に重水素に置き換えられ、強い正の散乱因子が導入される。 タンパク質結晶中の溶媒と不安定な水素原子だけを蒸気拡散で置き換えることで十分な場合が多い。 このような構造では、結晶中の交換可能な重水素原子の占有率は0-100%に精製され、交換量を直接定量することができる

。