液体クロマトグラフィータンデム四重極質量分析システム
開発した等質溶出系及びグラジェント溶出系ではジアゼパムとノルジアゼパムのピーク分解能（Rs≧3.1）は良好であった． ノルジアゼパム-d5およびジアゼパム-d5の標準品の保持時間は，アイソクラティック系でそれぞれ2.6 min (0.54 RSD %) および4.1 min (0.27 RSD %) であった。 表層水マトリックスでは、保持時間は標準品と同じで、RSD値はnordiazepam-d5およびdiazepam-d5でそれぞれ0.62%および0.30%であった。 グラジエントシステムにおけるワーキングスタンダードの保持時間はnordiazepamが2.4 min（0.90 RSD %），diazepamが2.9 min（0.70 RSD %）であった。 処理排水中の化合物の保持時間の精度をTable 1に示します。RSD値は≤0.35%でした。
処理排水サンプル中のジアゼパムとノルジアゼパムは、その特徴的なMS/MSトランジションと保持時間から同定されました(Table 1)。 各化合物について、1つのプリカーサーイオンと2つのフラグメントイオンがモニターされました。 天然由来のジアゼパムとノルジアゼパムの同定は、2つのフラグメントイオンから得られるピーク面積の比率を標準物質のものと比較することで行いました (Table 1)。 また、対象化合物の保持時間を、同じクロマトグラフィーランにおけるジアゼパム-d5およびノルジアゼパム-d5の保持時間と比較した。
固相抽出法の開発
酸性および中性水性試料中のジアゼパムとノルジアゼパムの安定性
採取した環境水サンプルは、汚染物質分析の前に酸性phで保存することが普通である。 本研究では，ジアゼパムとノルジアゼパムを実用標準物質（pH 3.1およびpH 7.0）として保存した場合の安定性を検討した。 その結果，ノルジアゼパムは室温で酸性溶液中に保存すると，広範囲に分解されることがわかった。 12日間でノルジアゼパムの56%が分解された（図2）。 4℃で保存した場合、分解はそれほど大きくなく、12日後には初期濃度の20%のノルジアゼパムが分解された。 一方、ジアゼパムは室温および4℃で保存した場合、pH 3.1で安定であることがわかった（Fig. 2）。 12日間で、室温では0.53%、4℃では3.1%のジアゼパムしか分解されなかった。 両化合物は、中性pHで12日間安定であることが示された。 12日目におけるジアゼパムとノルジアゼパムの応答（4℃および室温保存時）は、初期応答の101〜103%であった。 異なる時点での決定濃度に対するRSD値（n = 3）は≦5.1%であった。 この反応は当初廃水サンプルで発見されたが、条件を単純化し、廃水という非常に複雑なマトリックスにおける他の反応・作用の可能性を減らすため、調製溶液で実験が行われた。
精製水中の5mMギ酸におけるジアゼパムとノルジアゼパムの安定性、pH 3。 4℃で保存したジアゼパム（白い三角形）と室温での保存（黒い三角形）。 ノルジアゼパムは4℃（白四角）および室温（黒四角）で保存した。 実験の詳細は「Stability studies of diazepam and nordiazepam in acidic and neutral aqueous solutions」
我々の結果はノルジアゼパムがpH 3で不安定であることを示しており、これらの結果はノルジアゼパムが酸性溶液中で加水分解を受けることを示す文献の結果とも一致するものであった。 Archontakiらは、ノルジアゼパムが酸性水溶液中で加水分解され、分解の第一段階が可逆的であることを見出した。 しかし、本研究の結果は、ノルジアゼパム（およびジアゼパム）がpH 7よりもpH 2でより安定であることが判明した最近の研究結果とは相反するように思われるかもしれない。 この違いは、回収率測定の戦略の違いを考慮すると、実は予想されることである。 ノルジアゼパムの変質は蒸発と加熱で逆転するため、この方法の日常的な使用には実用的な意味はないだろう。 Matuszewskiらの勧告に従って回収率を推定し、低pHでのノルジアゼパムの不安定性を組み合わせて初めて、化合物の損失が発生するため、見かけ上高い回収率となります。
The solid phase extraction recoveries for simulated environmental water samples, stored at low sample pH
The solid phase extraction recovery and the matrix effect was determined in treatment water samples by LC-MS using the approach suggested by Matuszewski etc. 詳細は「方法の検証」に記載されています。 標識化合物は環境マトリクスに含まれないと考えられるため，同位体標識標準物質であるdiazepam-d5およびnordiazepam-d5について抽出回収率を測定した。 本研究では、ジアゼパム-d5とノルジアゼパム-d5の実用標準試料を5 mMギ酸、精製水pH 3.1/acetonitrile (90/10, v/v)、8℃で1週間以内に保存し、A-Cセットの調製に用いた。
低濃度と高濃度で決めた相対抽出回収率は、表2に示した（抽出方法は「試料調製と固相抽出」に示したとおり）。 抽出回収率はジアゼパム-d5よりノルジアゼパム-d5の方が高かった。 ノルジアゼパム-d5の相対抽出回収率は、低濃度で114±8.1%、高濃度で117±21%であった。 また、diazepam-d5で得られたRSD値は、低濃度時で6.0%、高濃度時で24%でした（Table 2）。 固相抽出法では，複雑なマトリックス中の微量成分の測定において，高いRSD値（≧18%）を示すことがあります。 さらに、環境水試料中のノルジアゼパムの高い抽出回収率（≥100%）も文献で報告されています。 後述するように、この高い回収率はノルジアゼパムと変換産物の化学平衡と相関している可能性があります。
ノルジアゼパム-d5の絶対抽出回収率は139±21%、マトリックス効果は119±3.0%と決定されました。 ノルジアゼパム-d5の高い絶対抽出回収率は、ノルジアゼパム-d5がMSインターフェースでイオン増強を受けたことで一部説明できる。 しかし、高い抽出回収率（上述した相対抽出では> 100%）は、ESIソースのマトリックス効果だけによるものではないことを示しました。 このことは、抽出試料と非抽出試料を同じマトリックスに溶解してLC-MS/MSシステムに注入したMatuszewskiらの方法に従って得られた相対抽出回収率によって判断された。 さらに、高い抽出回収率が質量分析計のインターフェースにおけるいかなるプロセスとも相関しないことをさらに検証するために、ジアゼパム-d5およびノルジアゼパム-d5の抽出回収率は、第2の検出技術であるLC-UVを使用して決定された。 リン酸緩衝液（pH 7.0）中のノルジアゼパム-d5の抽出試料をLC-MS/MSとLC-UVの両方で分析したところ，回収率はそれぞれ159％と153％（n = 2）であった。 その結果、ノルジアゼパムの高い抽出回収率は、質量分析計の処理に大きく起因するものではないと結論付けた。
結論として、得られた抽出回収率およびRSD値が高くても、標的化合物の濃度が低い（50および250 pM）ことと、化合物が複雑なマトリックスから抽出されていることから、おそらく妥当と思われるであろう。 本研究では、ノルジアゼパムについて得られたこれらの高い回収率が、Archontakiらによって見出されたノルジアゼパムと変換生成物の間の化学平衡に相関することを実証したいと考えた。
Regeneration of nordiazepam during sample preparation
Diazepam and nordiazepamの保存溶液（pH 3.1、室温、「酸性および中性水性試料中のジアゼパムおよびノルジアゼパムの安定性」）を用いてリン酸緩衝液をスパイクし、固相抽出を行ったところ、ノルジアゼパムの再構成抽出物から得られる応答は未抽出の保存溶液から得られる応答と比較して大きくなっていました。 固相抽出により、ノルジアゼパムのピーク面積は26面積カウント（2.7 RSD %, n = 3）から45面積カウント（14.6 RSD %, n = 3）へと増加した。
ノルジアゼパムが固相抽出中に再生されたことを確認するため、ノルジアゼパム-d5の保存サンプル1つ (m/z 213のフラグメントイオンで1470のピーク面積を与える) とノルジアゼパム-d5の処理サンプル1つ (1790のピーク面積) をLC-MS/MSシステムに注入した。 ノルジアゼパム-d5のSRMチャンネル（276→213）に加え、Table 1の2つのSRMチャンネルが追加で取得された。 ノルジアゼパム-d5の保存試料を注入し（n = 6）、SRMトランジションの比率を求めたところ、m/z (276 → 213)/(276 → 165) のフラグメントイオン比が1.4 (3.8 RSD %、m/z (276 → 213) / (276 → 140) のフラグメントイオン比が 1.0 (3.5 RSD %、m2) と判明しました。 ノルジアゼパム-d5の処理試料では、SRMのトランジション比は同じ、すなわち1.4と1.0でした。 このように、保存試料と処理試料のフラグメントイオン比に有意差は認められなかった。 さらに、保持時間も両試料で同じであった。
Archontakiらは、nordiazepamが酸性水溶液中で変換され、分子式C15H13N2O2Cl、モノアイソトピック質量288.1 Daの中間体N-(2-benzoyl-4-chlorophenyl)-2-aminoacetamideとなることを明らかにしました。 この変換生成物を結晶化し，LC-UV，GC-MS，1H-および13C-NMR，IRスペクトルにより分析した。 中間体とノルジアゼパムの化学平衡は可逆的であったが，中間体から最終分解物（C13H10NOCl）へのさらなる変換は不可逆的であった。 今回，ノルジアゼパムの保存溶液（pH 3.1）において，保持時間3.0分，質量電荷比289.0のイオンがLC-MSで検出された。 このイオンはノルジアゼパムの変換生成物の＋に相当すると考えられる。 また、3.0分のイオンの同位体パターンは、塩素原子1個の同位体パターンと一致した。 また、クロマトグラフィーのピークはノルジアゼパムより先に溶出したが、これはArchontakiらの逆相系でノルジアゼパムとN-(2-ベンゾイル-4-クロロフェニル)-2-アミノアセトアミドを分離した結果と一致する。したがって、本研究で貯蔵酸性水溶液から検出したピークは、おそらくN-(2-ベンゾイル-4-クロロフェニル)-2-アミノアセトアミドであると思われた。 また，本試験におけるN-(2-ベンゾイル-4-クロロフェニル)-2-アミノアセトアミドに対するノルジアゼパムのピーク面積比は0.75 (n = 2)であった。 しかし、蒸発させたメタノール混合液（実験の詳細は「酸性及び中性水溶液におけるジアゼパム及びノルジアゼパムの安定性試験」に記載）では、ノルジアゼパムとN-（2-ベンゾイル-4-クロロフェニル）-2-アミノアセタミドのピーク面積比は1.9（6.8 RSD %，n=4）、即ち、増加した。 のピーク面積が増加し、N-(2-ベンゾイル-4-クロロフェニル)-2-アミノアセトアミドのピーク面積が減少していることがわかった。 ブランク試料ではN-(2-benzoyl-4-chlorophenyl)-2-aminoacetamideおよびnordiazepamのピークは検出されませんでした。 これらの結果は、Archontakiらによって特徴づけられたノルジアゼパムとノルジアゼパムの変換生成物の化学平衡が、SPE抽出物の蒸発中にN-(2-ベンゾイル-4-クロロフェニル)-2-アミノアセトアミドからノルジアゼパムに移行したことを強く示唆するものであった。 また、ノルジアゼパムの最終分解物（C13H10NOCl）と相関するピークは検出されなかった。
このことから、ノルジアゼパムは酸性水溶液中で容易にN-（2-benzoyl-4-chlorophenyl）-2-aminoacetamideに変換されることが分かった。 興味深いことに，ノルジアゼパムは固相抽出の過程で再生された。 このため，pH 3.0のノルジアゼパム保存液を抽出回収率の計算の基準として使用すると，抽出回収率が過大評価されることになる。 これらの結果は、メソッドバリデーション、すなわち保存条件、抽出回収率、マトリックス効果を評価する際に重要である。 また、ノルジアゼパムの同位体標識アナログを内標準物質として使用しない場合、ノルジアゼパムの変換は分析結果全体に影響を与える可能性があります。 また、ノルジアゼパムの変質は、固相抽出前の保存期間だけでなく、乾燥SPE抽出物の再構成など、使用する溶液のpHによってもメソッドの精度に影響を与える可能性があることを強調しなければならない。
メソッドの検証
環境サンプル中にこれらの化合物が検出されなかったため、開発したメソッドを同位体ラベル化アナログ（diazepam-d5とnordiazepam-d5）の使用によって検証した（「Method validation」）。 標識類似化合物をメソッドバリデーションに使用する利点は，分析対象物が定量される実際のマトリックス中の微量レベルでメソッドをバリデートできることである。 排水処理サンプルにおける相対抽出回収率は，ジアゼパム-d5およびノルジアゼパム-d5ともに高濃度および低濃度で87%以上であった（Table 3）。 得られた値は、複雑なマトリックスから微量濃度の医薬品を抽出する際に期待される範囲内である。 また，イオンサプレッションを行ったため，抽出回収率の絶対値は63-86%と低くなった（Table 3）。 低濃度におけるマトリックス効果（ME %）は，ジアゼパム-d5が76 ± 14%， ノルジアゼパム-d5が88 ± 14%であった（Table 3）。 高濃度では、マトリックス効果およびRSD値は低濃度時と同じ範囲であった。 他の研究結果では、環境水のマトリックス効果は比較的高いことが示されているため、これらの ME % の数値は許容範囲内であると言えます。 本法の精度は、ジアゼパム-d5およびノルジアゼパム-d5の低濃度および高濃度でのSPE回収率を測定することにより決定しました（Table 3）。 相対回収率はジアゼパム-d5で88 ± 7.6%, 87 ± 12%，ノルジアゼパム-d5で98 ± 7.8%, 99 ± 6.1% でした。
に記載されています。
抽出した廃水試料中のジアゼパム-d5とノルジアゼパム-d5について得られた保持時間のRSD値で表されるクロマトグラフィーシステムの精度は、0.62%以下となりました。 また、抽出排水試料中のジアゼパム-d5およびノルジアゼパム-d5のピーク面積のRSD値は≦7.8%でした（「液体クロマトグラフタンデム四重極質量分析システム」）。 さらに、処理後の廃水試料における検量線の相関係数（R2）で表される直線性は、ジアゼパムおよびノルジアゼパムでそれぞれ0.988および0.957でした。
注入した精製Millipore水試料には分析物および同位体ラベル化化合物のピークが検出されず、本研究ではLC-MS/MSシステムでのキャリーオーバーは認められませんでした。 また，抽出されたリン酸緩衝液サンプルには目的化合物が含まれないため，サンプルの取り扱いや固相抽出でクロスコンタミネーションが発生した兆候は認められなかった。 そのため，本研究では自己汚染による偽陽性所見のリスクは最小化されたと考えられた。
ジアゼパム-d5およびノルジアゼパム-d5のLOQとLODを廃水処理試料で測定した。 定量下限はジアゼパム-d5およびノルジアゼパム-d5ともに5.0 pM (1.4 ng L-1) とし、S/N比は約10、精度は12.7および15.9 RSD % (n = 3)、すなわち規定精度の20 % 以内だった (Table 3)。 本研究で得られたLOQ値は，他の研究において廃水処理試料中のジアゼパムおよびノルジアゼパムで達成された値の範囲内であった。 しかし，この研究では，抽出された廃水は200 mLであったのに対し，本法では75 mLであった。 検出限界はジアゼパム-d5が1.7 pM（0.49 ng L-1），ノルジアゼパム-d5が2.0 pM（0.55 ng L-1）だった（Table 3）。4549>
環境水試料中のジアゼパムとノルジアゼパムの定量
開発したLC-MS/MS法を環境水試料に適用し、ジアゼパムとノルジアゼパムを定量した結果、ジアゼパムとノルジアゼパムは室温または4℃の温度で12日間安定であることが分かりました。 開発した方法は，保存前に理想的な内部標準物質，すなわち対象化合物の同位体標識化合物を試料に添加すれば，酸性条件下の環境試料中のジアゼパムとノルジアゼパムの定量に適用できることを強調しなければならない。 本研究では、同位体標識化合物であるdiazepam-d5とnordiazepam-d5を内部標準として用い、化合物の潜在的な変質などの損失や分析中の変動を補償した。
処理排水と表流水試料についてdiazepamとnordiazepamの分析を行った結果、nordiazepamとdiazepam-d5を含む試料は、酸性条件下でも安定に存在することが確認された。 標準溶液で得られたイオン比（表1）と「天然」由来のジアゼパムまたはノルジアゼパムで得られたイオン比の間には、t検定で5％レベルの有意差はありませんでした（P ≥ 0.07）。 ジアゼパムおよびノルジアゼパムの濃度は、それぞれ8.5 (2.4 ng L-1) および66 pM (18 ng L-1) と測定された。 14日後に採取した同じ排水処理場の試料では，ジアゼパムおよびノルジアゼパムの濃度は，それぞれ7.5 (2.1 ng L-1) および75 pM (20 ng L-1) と測定された。 したがって、ノルジアゼパムの濃度はジアゼパムの濃度より約1桁高いことが決定された。 これらの結果は、廃水に関する他の研究結果と一致するものである。 さらに，文献上では，ノルジアゼパムは定量されたが，ジアゼパムは検出されなかった処理水試料が報告されている． 本研究では、排水処理施設Kungsängsverketから3 km上流のFyris川で採取した表流水からジアゼパムもノルジアゼパムも検出されず、上流での人為的排水の排出がほとんどないことが示された
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