生物物理学者のアダム・コーエンは、2010年にカリフォルニア州サンフランシスコを散歩していたとき、ある電話に驚かされた。 「信号がある」と電話の主は言いました。 5,000キロ近く離れたマサチューセッツ州ケンブリッジで、彼の共同研究者たちが金脈を発見したのだ。 数カ月にわたる実験の後、研究者たちは蛍光タンパク質を発見し、ニューロン間を通過するシグナルを観察できるようになったのだ。 ハーバード大学の研究室に戻ったコーエンは、実験のすべての記録が奇妙な経過をたどっていることを知った。 最初は、タンパク質で装飾されたニューロンが、電気インパルスがその中を飛び交うと、きれいに光ったのです。 しかし、その後、細胞は明るい塊に変わってしまった。 「録画の途中から、信号が乱れるのです」とコーエンは言う。
そこで彼は、実験中の彼のチームに加わることにしました。 「録音を始めると、彼らは息を止めて座っていました」とCohenは言います。 しかし、うまくいっているとわかるとすぐに、彼らは「踊りながら部屋の中を走り回り」、祝杯をあげるのです。
その興奮のあまり、彼らはデスクランプの光を顕微鏡に直接当てていたのです。 当時コーエンのグループの大学院生だったダニエル・ホッホバウムは、「私たちは実際に自分たちの興奮を記録していたのです」と言います。 特定の哺乳類ニューロンに組み込んだ蛍光タンパク質を使用して、個々の電気インパルスをリアルタイムで追跡できることを示した最初の研究の 1 つです。 電圧測定の主力製品である電極は、個々のニューロンの活動を確実に記録することができますが、多数のニューロンの信号を、特に長時間にわたって捉えることは困難です。 しかし、過去20年の間に、蛍光を発する電圧指示タンパク質を神経細胞の細胞膜に埋め込む方法が発見された。 適切な顕微鏡を用いれば、細胞が互いに語り合っている様子を、ささやき声であれ叫び声であれ、光で確認することができる。 また、電圧イメージングでは、多数の神経細胞間の電気的な会話を一度に記録し、脳組織の大きな塊全体でそれらの信号を平均化することができます。 これにより、研究者は、個々の細胞の声だけでなく「群衆の咆哮」にも耳を傾け、異なる空間スケールで脳の電気活動を研究することができます、とCohenは述べています。
これらのタンパク質が改良され、顕微鏡の進歩によってそれらを見ることが容易になると、科学者は神経科学の最大のパズル、脳細胞が協力して電気パルスを思考、行動、感情に変換する仕組みに光を当てることを期待しています。 研究者たちは、脳組織の奥深くで高速に発火する神経を観察する方法を考案し、活動の全容を把握することにまだ苦心している。 しかし、進歩によってこれらの技術的な課題が解決されれば、「革命的なことだ」と、ニューヨークのコロンビア大学で神経回路の機能を研究している Rafael Yuste 氏は述べています。 樹状突起に到達した化学的または電気的信号は、細胞の膜を横切って小さな電圧変化を生じさせ、それが細胞本体に送られる。 電圧変化の合計が閾値と呼ばれる戻れないポイントに達すると、ニューロンは大きな電気的スパイク、すなわち活動電位を発生させる。 この衝撃は、軸索と呼ばれる神経細胞の枝に沿って、別の枝状付属器まで秒速150メートルの速さで飛ばされる。 ここで、化学的または電気的な信号が、次の樹状突起に情報を伝えます。
神経細胞の信号は収束、発散、同期して、顔の紅潮から赤ちゃんのしゃっくりまで、思考、感情、行動、反応のシンフォニーを生み出します。 しかし、科学者の聴くツールは極めて限られている。 1940年代に初めて開発された、髪の毛ほどの細さの小型電極を脳内に挿入し、神経細胞に当てたり、内部に入れたりして、膜電圧を正確かつ高速に測定することができる。 しかし、この方法では、一度にモニターできる神経細胞は1つか数個にすぎず、しかも電極が細胞を傷つけてしまうため、限られた時間しかモニターできない。 それは、一人の奏者を数秒間追いかけることで、オーケストラの編成の要点を把握しようとするようなものです。
より多くの細胞集団における静かな脳活動を測定するため、1960年代の科学者は、電気信号に反応して蛍光を発するセンサーまたはプローブのアイデアを検討し始めました。 最も一般的なプローブはカルシウムインジケータと呼ばれ、電気信号のスパイクの結果として神経細胞に流れ込むカルシウムと結合すると発光するものである。 しかし、カルシウムイメージングと呼ばれるこの技術は、膜電圧を直接記録するものではなく、あくまで代理的なものでしかない。 カルシウムイメージングは、活動電位のような大きな事象の信号は映し出しますが、膜電圧の微妙な変動や活動電位を抑制する電気信号など、脳機能にとって重要なものは見逃してしまうのです。 オーケストラが演奏したことは明らかですが、何を演奏していたかは誰にもわからないのです。
1970年代、科学者たちは、膜電圧の変化を直接検出する色素センサーの開発を開始しました。 この色素の最初のバージョンは、脳に無差別に塗らなければならなかったので、非神経細胞を含むすべての種類の細胞を標識し、特定の神経細胞の活動を解析することが困難であった。
そこで1990年代、研究者たちは、目的のニューロンだけに表示されるよう遺伝子操作された指標をテストし始めた。 1997年に最初のGEVI（genetically encoded voltage indicator）が開発され、それ以来、科学者は20種類以上のセンサーを作り出してきた4。 これらの中には、電圧に敏感なタンパク質と蛍光分子を組み合わせたものもある（「蛍光の種類」参照）。 これらのタンパク質は、電圧の変化を検知すると立体構造を変化させ、結合している分子の蛍光を変化させる。 この蛍光性分子は、光に反応して細胞膜の電圧を変化させる。 これらのタンパク質は、膜電圧の変化に応じて光に対する応答、つまり蛍光を変化させるという、逆の働きもすることができる。
All in the detail
これまでのところ、GEVI は皿で培養した神経細胞と、昆虫5からマウス6まで幅広い動物の無傷の脳の両方で個々の活動電位の追跡に成功していることが証明されています。 この技術の最大の特長は、大きな事象だけでなく、ニューロンが近隣の細胞から受け取るメッセージを反映する、膜電圧の小さな閾値以下の変化も記録できる可能性があることだ、とCohenは言う。 「電圧イメージングによって、以前は見る方法がなかった、生体内のニューロンへの入力を見ることができます」と彼は言います。
この1年間で、Cohenたちは新しいGEVIと顕微鏡技術の改善を行い、マウス脳を含む多くのニューロンから一度にこのような閾値以下の電圧変化を記録しました7、8。 また、同じ神経細胞の電気的活動を1週間後まで記録することができた。 ケンブリッジにあるマサチューセッツ工科大学の神経科学者Ed Boyden氏は、「どのニューロンが記録されているかを正確に把握し、長期間にわたって追跡することができるため、それらのニューロン間の配線を調べることができる」と述べている。 そうすることによって、「脳の構造とその機能を結びつけることができるのです」とボイデンは言う。 GEVIのもう1つの利点は、主に細胞体からの信号を記録する電極とは異なり、神経細胞のどの部分からでも、樹状突起の先端まで電気信号を記録できることです（「Hitting the scales」参照）。 これは、ピアニストの左手が奏でる音を特別に聴くことができるようなものです。 「カナダのケベック市にあるラヴァル大学の神経生物学者であるカタリン・トートは、「これは私が長い間夢見てきたことです。 イリノイ州シカゴ大学の神経生物学者であるWei Weiは、GEVIを使用して、マウスの網膜のニューロンで異なる電気入力がどのように統合されるかを研究しています。 Wei氏は、特定の方向に動いているときに視覚刺激に対してより強く反応する一群の神経細胞に興味を持っています。
パリの高等師範学校の神経物理学者Vincent Villetteは、電圧センサーを使用して、閾値以下の電気信号の規則的な変動が、マウスの小脳内の神経細胞の筋活動の調整方法を決定することを研究しようと考えています。 Villette 氏は、「細胞がどのように協調して作用するかについて、理解すべきことはたくさんあります」と述べています。
膜電圧を視覚的に読み取ることにより、科学者は、ニューロンの発火を誘発するのではなく、抑制する電気信号も見ることができます。 抑制信号は、カルシウムイメージングなどのアプローチでは記録できないため、それらが脳の活動をどのように正確に形成しているのかは不明です、とフランスのマルセイユにある地中海神経生物学研究所の神経生物学者、Rosa Cossartは述べています。
Cossart氏は、何年も電極とカルシウムイメージングを使用してきましたが、現在はGEVIを試してみたいと考えています。 このセンサーによって、生きているマウスの複数のニューロン（少なくとも50個）の電圧を同時に高速で測定できるようになると、彼女は期待しています。 これは、ニューロンのグループが、興奮性と抑制性の両方の電気信号を統合して、脳の発達と機能にとって重要な活動をどのようにサポートしているかを理解するのに役立つと、彼女は言います。 カリフォルニア州スタンフォード大学の大学院生だったヘレン・ヤンは、ミバエの視覚系のニューロンを研究する方法として、GEVIを試してみることにしました。 しかし、最初の実験で顕微鏡を覗いてみると、ヤンさんは、ハエの目に明るい光を当てても、細胞の蛍光に何の変化も見いだせなかった。 データを解析して初めて、彼女は視覚刺激によって信号が発生していることに気づいた。 「私はかなり興奮しましたが、研究室の仲間はそれほどでもなかったようです」と彼女は言う。 「Yangは顕微鏡の設定をいじり始め、レーザー出力を上げ、イメージングを高速化しました。 「私は基本的に、私たちの顕微鏡ができるのと同じ速さにしました」と彼女は言います。 電気信号に対するインジケーターの反応は非常に速く、蛍光の変化はほんの1秒程度しか検出できないからだ。 「細胞が反応している間に 1 フレームしか撮影していないと、反応はまったく大きく見えません」とヤンは言います。
ヤンは最終的に、GEVI を使用して、ハエの神経細胞が視覚的な合図を処理する方法を調べることに成功しましたが5、彼女が直面した種類の課題が、電圧イメージングが主流の手法になるのを阻んでいます。 Cohen教授によれば、電圧イメージングには高度な顕微鏡プラットフォームが必要であり、しばしば特注品も必要となるという。 「おばあちゃんの蛍光顕微鏡でできるわけではないのです」。
過去5年間、BRAINイニシアチブからの資金援助は、より良いGEVIの開発を含む、この分野の進歩を後押ししたと、スタンフォードのタンパク質エンジニアであるマイケル・リンは言います。
新しいセンサーの開発と並行して、科学者たちは、脳を伝わる高速の電気信号を正確に画像化する技術に取り組んでいます。 課題の1つは、利用可能な技術のほとんどが、皿の中の細胞や脳の表面の細胞に対してのみうまく機能することである。 カリフォルニア大学バークレー校の物理学者であるNa Jiは、「哺乳類の脳は透明ではなく、まるで豆腐のようだ」と言う。
より深く観察するためには、周囲の組織を取り除いたり、マイクロ内視鏡という小さな光学機器を脳に直接突き刺したりするなど、より侵襲的な方法に頼らざるを得ません。 しかし、2光子顕微鏡は、不透明な組織（深さ1ミリ程度まで）を非侵襲的に観察することができる方法です。 この技術では、より長い波長とより低いエネルギーの光を使用し、組織の奥深くまで浸透させることができます。 二光子顕微鏡は、一度に一箇所だけを照射して記録するので、脳の高速のおしゃべりを追跡するには画像が遅すぎるのだ。 しかし、専門家は、技術の進歩により、近い将来、GEVIが発する信号をより高速で見ることができるようになると確信している。 「1128>
異なるアプローチがこれらの課題を克服することができれば、電圧イメージングが脳活動を測定するための標準的なアプローチになることに疑いの余地はありません。 スタンフォード大学の神経生物学者 Thomas Clandinin は、「来年か再来年には、電圧センサを適用して生物学を学んだ多くの論文を目にすることになるでしょう」と述べています。 この技術は、神経細胞がどのように情報を処理し統合するかに関連した疑問に対して、電極に取って代わるかもしれないとも言われている。 。