表1
励起、発光、輝度
複数の蛍光タグを使用する場合、利用できるレーザーでターゲットにできる励起ピークと同様に、明確な発光ピークのものを選ぶことが重要である。
明確なシグナルを達成し、潜在的なバックグラウンド蛍光を克服するために、利用可能なスペクトル内で最も明るい蛍光タグを選択することが一般的です。 輝度値は、タンパク質の消光係数と量子収率の積である。 したがって、EGFP のような明確に定義されたタグに対する蛍光タグの輝度は、一般的な代替指標となります。
成熟と白化
Maturation とは、蛍光タグが正しく折り畳まれて発色団を形成し、蛍光を発するようになるまでの時間を定義します。 生きている細胞で時間に敏感なイベントを行うには、短い成熟時間が重要になることがあります。 例えば、Superfolder GFP (sfGFP) は10分以内に折り畳まれますが、mOrangeは4時間以上かかります。
ブリーチは光安定性の指標で、励起後どのくらいで発色団が光を放出する能力を失ってしまうかを表します。 長時間のタイムラプス実験を計画している場合、高い光安定性を持つタグを検討してください。 T-サファイアの白化半減期 (t½; 最初の発光速度 x photons/s が半分になるまでの時間) は 25 秒ですが、EGFP はより安定で、白化半減期は 174 秒です。 使用予定の環境によっては、条件を若干調整するか、より適切なタグを選択する必要があります。
pHは励起および発光ピークに影響を与え、大多数の蛍光タグは酸に敏感です。pH変化により蛍光強度が変化するもの（例：pHTomato）さえもあります。 pKa値は、発色団の半分が蛍光を発するpHを示すため、pH感度のよい指標となります。
さらに、温度と酸素レベルは成熟時間に影響します。低酸素状態は、蛍光タグの最適範囲外の温度（たとえばEGFPは37℃で動作するように最適化されています）と同様に成熟時間を遅らせる傾向があります。 しかし、ニホンウナギから単離されたGFPであるUnaGのような新しい蛍光タグは、酸素レベルが低くても蛍光を発することができます3。
コドンの最適化
ほとんどの蛍光タグは、哺乳類の細胞や組織ではなく、クラゲやサンゴのタンパク質から得られるため、使用するアミノ酸コドンには種間の違いがあることがあります。
幸いなことに、新しいバージョンの蛍光タグの多くは、哺乳類細胞の好みを反映するようにコドンが最適化されています。 例えばGFPでは、Jürgen HaasらがGFPのコドン配列を変更することにより、シグナルを40～120倍に向上させました4。
融合タンパク質を作るために古いプラスミドを使っている場合、変更した蛍光タグ配列が入っていない可能性があります。
オリゴマー化
タグが単量体か二量体か（単量体は通常タンパク質名の前に「m」をつけて表す、例：mCherry）、それが実験に影響するかどうか判断することが重要です。 初期の蛍光タグの多くはオリゴマーを形成しやすく、オリゴマー化は融合タンパク質の生物学的機能に影響を与える可能性がある。 例えばEGFPは単量体であるが、十分な高濃度で使用すると二量体を形成し、細胞内小器官5を歪ませたり、FRET6などの実験を妨害する可能性がある。
GFP および mCherry 製品
大半の場合、真に単量体の FP を推奨します。