細胞の海を泳ぐ。 なぜシングルセルゲノミクスなのか」
複雑な生物学的システムは、複雑な「ダンス」を行う個々の細胞の協調機能から生じ、それぞれがアンサンブルに独自の特別な役割を果たします。 この複雑さゆえに、生物、組織、または細胞集団における遺伝子発現研究は、従来のバルクRNA-seq法を用いることによってしばしば制限されます。 科学者である私たちは、希釈したRNAの混合物で実験を行うために「すり潰して見つける」場合、目的の細胞で何が起こっているのかをほんの少ししか把握できていないことを直感的に理解しています。 実際、バルク RNA 発現分析では、実際にはどの細胞も存在しない (または非常に少ない) 推測された状態を記述することがよくあります！
おそらくあなたは神経科学者で、マウスの脳で、特定の神経伝達物質を生成するニューロンのサブ集団の発達を研究していると思います。 その集団を分離して、細胞ごとに分析することができれば、潜在的な洞察は、まさに、神経を刺激するものとなるでしょう! 同様に、癌の研究においても、腫瘍における遺伝子発現や、おそらくより重要な細胞の不均一性を、どのように解明すればよいのでしょうか。 腫瘍間だけでなく、腫瘍内の違いを比較し、腫瘍の微小環境に関連する免疫細胞集団を調べることができたらどうでしょうか？ バルクRNA-seq法では不明瞭になりがちなこの多様性は、シングルセルRNA-seqを用いて、臨床的に重要な細胞集団を特異的に探索することで明らかにすることができるのです。 バルク解析の欠点の例は豊富にあり、これら複雑な生物学的システムのすべてではないにしても、ほとんどの細胞タイプの違いを解剖することは、特に発生時や疾患の進行における貢献度を理解する上で重要である。
10x Genomics の単一細胞 RNA-seq (scRNA-seq) テクノロジーである Chromium™ Single Cell 3′ Solution では、マイクロ流体パーティションを使って単一細胞を捕獲し、バーコード付きの次世代シーケンス (NGS) cDNA ライブラリを準備することにより、細胞単位でトランスクリプトームを解析することができます。 具体的には、マイクロ流体チップ上に単一細胞、逆転写（RT）試薬、バーコード付きオリゴヌクレオチドを含むGel Beads、オイルを組み合わせ、Gel Beads in Emulsion（GEM）と呼ばれる反応ベシクルを形成させる。 GEMはチップのマイクロ流路内で並列に形成され、ユーザーは7分間のクロム装置の運転で100から10,000の単一細胞を処理することができます。 最大 65% の高い細胞回収率を維持しながら、低いダブレット率を確保するために、単一細胞を含む GEM の数を最大化するために、限界希釈率で細胞がロードされることに注意することが重要です。 各GEM反応ベシクル内で、単一の細胞が溶解し、Gel Beadが溶解して、同一にバーコード化されたRTオリゴヌクレオチドが溶液中に遊離し、ポリアデニル化mRNAの逆転写が行われる。 その結果、単一細胞からのすべてのcDNAは同じバーコードを持つことになり、シーケンシングリードは元の単一細胞にマッピングされることになる。 これらのバーコード付きcDNAからNGSライブラリーの調製は、非常に効率的なバルク反応によって行われます。 以下のビデオでは、この仕組みを視覚的に説明しています。
サンプルプレパレーションからハウツービデオまで。
Chromium Single Cell 3’ワークフローでは、まず目的の細胞を採取し、次に試薬キットとChromium Controllerを使用してNGSライブラリーを構築します。 バーコード付きcDNAライブラリーの調製（上記のビデオで一般的に説明されているように）は重要なステップであり、「garbage in, garbage out」ということわざ通り、高品質の細胞懸濁液を調製することがRNA-seqデータを最大限に引き出すための鍵になります。 細胞調製プロセスでサポートが必要な場合は、神経組織の解離やscRNA-seqに使用するコケプロトプラスト懸濁液の調製など、弊社ウェブサイトで複数の実演プロトコルを公開しており、サポートウェブサイトではさらに多くのプロトコルを定期的に追加しています。 懸濁液中のサンプルの最適な調製方法に関するガイダンスや推奨事項は、ベストプラクティスや一般的なプロトコルを参照できる当社のシングルセル調製ガイドから始めるとよいでしょう。 視覚的に学習されたい方は、How-to-videos（特に第4章から第7章）をご覧いただくと、サンプルおよびライブラリーの調製プロセスについてご理解いただけると思います。
-
Single Cell Prep Guide
-
デモプロトコル
-
How-JapanHow-Topics
はこちら
-
Chromium™ Controller
-
User Guides
-
How->Videos4228>
-
Cell Ranger™ Software
-
Loupe Cell Browser
-
How-to-Videos
あなたのデータを分析します。 one cell at a time
ライブラリーを調製した後、イルミナ®シーケンサーを用いてシーケンシングを実施します。 これが、シングルセルのRNA-seqデータから生物学的な洞察を得るという楽しい部分につながります! Chromium Single Cell 3′ Solutionから得られる（可能性のある）膨大な量のデータは、推測の域を出ないように設計された弊社のソフトウェアと可視化ツールによって簡単に処理することができます- Cell Ranger™ ソフトウェアは、バーコード付きシーケンスデータをシングルセル発現解析に適したファイルに変換し、可視化はLoupe™ Cell Browserを介して行われます。 ソフトウェアの使い方のステップバイステップのチュートリアルをご希望の場合は、How-toビデオの第8章から第11章までで、Cell Rangerソフトウェアによる転写産物のカウントからLoupe Cell Browserによる美しいデータの可視化まで、すべてをご紹介しています。 また、Seurat、Monocle、Cell Viewなど、コミュニティによって開発されたシングルセル解析ツールも増えてきています。 これらの解析ツールやその他のシングルセルの記事については、10x Genomics Blog でお読みください。ここでは、重要な研究貢献のハイライト、ヒントやコツの提供、シングルセルに関するあらゆる最新情報をお伝えします！
Chromium Single Cell 3′ Solution を始めるにあたって他に質問や疑問がありましたら、ここにコメントを残すか直接私たちに連絡してください。 脳内器官形成の追跡、急性骨髄性白血病患者の骨髄移植の研究、腸管幹細胞の自己再生のための新しい経路の解明など、Chromium Single Cellの出版物は日々増えています。