Atractylodes macrocephala Koidz水抽出物の経口投与がマウスのマクロファージおよびT細胞の炎症反応に及ぼす影響

Abstract

Atractylodesマクロセファラ（AM）の根茎は様々な気の強化複合処方箋に含まれる成分である． AM水抽出物（AME）を経口投与し、マウスから分離したマクロファージとT細胞における炎症反応を評価した。 チオグリコール酸を注射したマウスから腹膜滲出液を分離し、スカベンジャー受容体の変化を検討した。 腹膜マクロファージはリポポリサッカライド（LPS）で刺激した。 LPS腹腔内注射に対する血清サイトカイン反応も評価した。 脾臓細胞は単離され、その組成と機能的反応を測定した。 抗炎症成分として知られるアトラクチレノライドIとアトラクチレノライドIIIのAME中の含有量は、それぞれ0.0338 mg/gエキスと0.565 mg/gエキスであった。 AMEはチオグリコール酸に応答してSRA(+)CD11b(+)細胞数を増加させた。 AME群から分離した腹膜マクロファージは、腫瘍壊死因子（TNF-）α、インターロイキン（IL-）6、誘導性一酸化窒素合成酵素、シクロオキシゲナーゼ-2などの炎症マーカーに変化は見られなかったが、CD86発現量の減少が見られた。 興味深いことに、AMEはLPSの腹腔内投与により、TNF-αおよびIL-6の血清レベルを低下させた。 適応免疫系に関しては、AMEは脾臓のCD4（+）T細胞集団と主要組織適合性複合体クラスII分子の発現を増加させ、AME群の培養脾臓細胞はT細胞活性化中のインターフェロン-γ産生の減少と同時にIL-4の産生を増加させた。 AMEは炎症反応中の腹膜マクロファージの補充を促進したが、その抗炎症活性はマクロファージ活性の調節を介するものではないようであった。 AMEはまた、CD4 T細胞の免疫状態を変化させ、Th2反応を促進した

1. はじめに

炎症は有害な刺激を排除するための防御反応であり、免疫細胞はこのプロセスの主要な参加者である。 免疫細胞は、抗原認識の様式や記憶反応の生成能力によって、自然免疫系と適応免疫系に分けられる。 マクロファージや樹状細胞などの自然免疫系は、限られた受容体特異性で抗原に瞬時に反応する。 適応免疫系は、T細胞とB細胞からなり、抗原特異的で、末梢リンパ組織に侵入した抗原に対して応答を開始し、記憶応答を生じさせる。 炎症の初期には自然免疫細胞が主役ですが、時間の経過とともに適応免疫細胞が主役になります。

組織常在のマクロファージは、免疫と組織の健全性に重要な役割を果たします。 ほとんどの組織マクロファージは胚の前駆体から派生している。 定常状態では、その寿命と局所的な増殖によって個体数が維持され、一部のマクロファージは血液中の単球由来細胞によって補充される 。 炎症が起きると、骨髄由来の単球がその場に集められ、マクロファージに分化する . マクロファージは、貪食作用により病原体や抗原を排除するとともに、腫瘍壊死因子（TNF-）α、インターロイキン（IL-）6、誘導性一酸化窒素合成酵素（iNOS）、シクロオキシゲナーゼ（COX-）2などのサイトカインや酵素を産生して炎症反応を誘導しています。 また、マクロファージは、T細胞に抗原を提示する専門的な抗原提示細胞（APC）の一種です。

T細胞は、主にCD4 T細胞とCD8 T細胞からなり、APC上の主要組織適合性複合体（MHC）分子が結合した抗原性ペプチドにT細胞受容体（TCR）が接触すると、活性化されます … T細胞の3分の2以上を占めるCD4 T細胞は、Th1、Th2、Th17、T濾胞ヘルパー、T制御細胞など様々なエフェクターTヘルパー（Th）細胞に分化することができる。 これらのサブセットのうち、Th1細胞とTh2細胞は、最初に定義されたタイプである。 Th1細胞はインターフェロン（IFN）γを大量に分泌し、マクロファージを活性化して細胞内病原体の防御に有効である。一方、Th2細胞はインターロイキン（IL）4、IL-5、IL-13を分泌し、好酸球とマスト細胞を動員して蠕虫の感染から宿主を保護する ……。 これらのTヘルパー細胞は宿主の防御に重要であるが、どのタイプのTh細胞も慢性的に活性化されると、免疫介在性障害を引き起こす可能性がある。 Th1細胞は臓器特異的な自己免疫や慢性炎症性疾患に重要な役割を果たし、Th2細胞はアレルギー性炎症に関与する。

Compositaeに属するAtractylodes macrocephala Koidz（AM）の根茎は、食欲不振、腹部膨満、下痢などの消化器系の機能異常治療に使用されてきた。 漢方では、消化管内の水分の異常貯留を解消して気を活性化させるとされています。 AMは、様々な補気薬の処方箋の構成成分である。 漢方医学では、気の本質的な働きのひとつに防御があります。 このため、気を高める薬草は免疫システムを高めると考えられている。 気の流れを良くする薬草は、明らかな欠陥のない人の免疫状態を改善するために予防的に服用されるため、健常者が気の流れを良くするために服用した場合、免疫系がどのように変化するかを評価することが必要です。 AMは、アトラクチレノライドI、アトラクチレノライドII、アトラクチレノライドIIIなどのいくつかの生理活性セスキテルペノイドとポリアセチレンが含まれています。 マクロファージをアトラクチレノライドI、アトラクチレノライドIII、ポリアセチレン化合物で処理すると、リポポリサッカライド（LPS）によるTNF-αおよびiNOSの発現が抑制された。 また、これらの脂溶性成分をマウスに経口投与したところ、抗炎症作用が認められた。 しかし、伝統的なハーブ製剤の多くは水をベースとした煎じ薬であり、薬理学的に活性な脂溶性成分の収量は少ない。 さらに、ポリアセチレン類は沸騰水で容易に破壊される。 そこで、AMの煮汁抽出物（AME）を投与したマウスから分離したマクロファージに抗炎症反応が起こるかどうかを検討したいと考えた。 また、AMEが血清炎症反応に及ぼす影響についても検討した。 最後に、AME投与後の適応免疫系の変化について、脾臓細胞の組成と機能的反応を調べた。 試料の調製

Eusung (韓国)産のAMは、E-Pulip Co. (Lot. EPL1356-4) (Seoul, South Korea)から購入した。 バウチャー標本（# 2013-AM）はKyung Hee University, Herbal Immunology Laboratoryに寄託された。 簡単に言うと、試料100gを粉砕し、還流装置と加熱マントルを用いて1Lの脱イオン水（DW）で95℃、2時間抽出し、Whatman number 2 filter paper（Whatman International, Kent, England）で濾過することにより抽出した。 抽出物をロータリーエバポレーターを用いて濃縮し、真空下で凍結乾燥させた。 AMEの収率は37.7％であった。 高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析のために、0.4 gのAMEを10 mlのDWに溶かし、25℃で5分間超音波処理した。 抽出液を酢酸エチルに加え、振って混合し、1分間静置した。 上層の酢酸エチルを移し、この操作を3回繰り返した。 最終酢酸エチル層を濃縮し、凍結乾燥した。 HPLC

オートサンプラー（SIL-20A）、バイナリーポンプ（LC-20AD）、フォトダイオードアレイ検出器（SPD-20A）からなる逆相HPLCシステム（島津20A、京都、日本）、YMC-Triart C18 カラム（5μm × 4.6mm × 250mm）（YMC、京都、日本）によって、試料を解析した。 2溶媒系（溶媒A：0.05%リン酸水溶液，溶媒B：アセトニトリル）のグラジエントフローは以下の通りであった。 85% A/15% B at 0 min, 85% A/15% B at 5 min, 50% A/50% B at 15 min, 50% A/50% B at 20 min, 40% A/60% B at 25 min, 40% A/60% B at 30 min, 15% A/85% at 35 min, 15% A/85% at 40 min, 85% A/15% at 42 min および 85% A/15% at 45 min. 移動相の流速は1.0 ml/min、注入量は10 μlとした。 検出は、atractylenolide III (Sigma, St. Louis, MO, USA) の場合は220 nmで、atractylenolide I (Sigma) の場合は280 nmで行った

2.3. 動物

7週齢の雄Balb／cマウスをSamTaco（Osan、韓国）から入手し、12時間の明暗サイクルで温度と湿度が制御された病原体のない動物施設に収容した。 すべての動物は、実験前に1週間の調整を行った。 投与量は、マウスとヒトの体表面積の差から外挿した計算により決定した。 体重60kgの成人ヒトに対するAMの推奨用量は、1日当たり生植物8〜24gまたは1日当たり抽出物3〜9g（本試験での抽出収量に基づく）である。 マウスに対する用量は、ヒトの等価用量50-150 mg/kg×12.3（換算係数）＝マウスの用量615-1,845 mg/kgで求めることができる。 この用量範囲に基づき，本研究では500 mg/kgと2,500 mg/kgの用量を選択した。 動物は実験群に無作為に割り当てられた。 AMEは1日1回、10日間経口投与した。 実験期間中、群間の体重に差はなかった。 動物プロトコルは、Kyung Hee UniversityのInstitutional Animal Care and Use Committee（KHUASP（SE）-15-012）により承認され、マウスはUS National Research Council for the Care and Use of Laboratory Animals（1996）の仕様に準じて世話された

2.4. マクロファージの調製

マクロファージの単離のために、マウスは犠牲の4日前に3.5％滅菌チオグリコレート（BD、スパークス、MD、米国）を2ml腹腔内注射された。 実験終了後、マウスを頸椎脱臼により犠牲にし、10％牛胎児血清（FBS；Hyclone）及び1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含む冷DMEM（Hyclone，Logan，UT，USA）を用いた腹膜洗浄により腹膜滲出細胞を無菌的に単離させた。 遠心分離後、細胞を再懸濁し、TC20 Cell Counter (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) を用いて計数した

2.5. 脾臓細胞の調製

脾臓細胞の単離のために、脾臓は実験終了時に無菌的に得られた。 1％FBSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含むRPMI1640（Hyclone）中のスライドガラス間で脾臓を破砕した後、細胞を70-μmセルストレーナーで濾過した。 遠心分離後、BD PharmLyse lysing buffer（BD Biosciences, San Diego, CA, USA）を用いて赤血球を溶解させた。 細胞を10％FBSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含むRPMI1640に再懸濁し、T20セルカウンターを用いて計数した＜2460＞＜7669＞2． LPSの腹腔内注射

実験終了時にマウスに1.3mg/kgのLPS（血清型055：B5、シグマ）を腹腔内注射した。 1時間後、マウスをエーテルで麻酔し、心臓穿刺で血液を採取した。 血清を得、分析まで-20℃で保存した。

2.7. 細胞培養

腹膜滲出液細胞を6ウェルプレートまたは60mmディッシュにプレーティングし、37℃で一晩インキュベートした。 付着していない細胞を除去した後、付着した細胞を100 ng/ml LPSで24時間刺激し、上清と細胞をその後のアッセイのために回収した。 脾臓細胞を24ウェルプレートにプレーティングし、2μg/ml抗CD3抗体（BD Biosciences）で48時間刺激し、上清をサイトカイン分析のために回収した。 フローサイトメトリー

細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、FACSバッファ（PBS/0.1% NaN3/1% FBS）に1×106 cells/mlで再懸濁した。 細胞をラット抗マウスCD16/CD32抗体（BD Biosciences）で4℃、5分間ブロックし、フルオレッセイン標識抗マウスSR-AI、PE標識抗マウスLOX1（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）、PE標識抗マウスCD36で染色した。 FITC標識CD11b、PE標識抗CD11b、PE標識抗マウスCD86、FITC標識抗マウスCD4、PE標識抗マウスCD8a、FITC標識抗マウスCD19、FITC標識抗マウスIA／IE（BDバイオサイエンス）（抗体はすべて1希釈しています。を暗黒下、氷上で30分間反応させた。 非特異的結合を示すために、一致したアイソタイプ抗体を使用した。 細胞を洗浄し、FACSバッファーに再懸濁した。 合計10,000イベントをNaviosフローサイトメーター（Beckman Coulter, La Brea, CA, USA）で取得し、Kaluzaソフトウェア（Beckman Coulter）を使用してデータを処理した

2.9. サイトカイン分析

上清および血清中のTNF-α、IL-6、IFN-γ、およびIL-4のレベルを、BD OptEIAマウスELISAセット（BD Biosciences）を用いて、製造者のプロトコルに従って決定した。

2.10. Proliferation Assay

96ウェルプレート中の脾臓細胞（4×105）を可溶性抗CD3 mAb（2μg/ml）で48時間刺激し、細胞増殖はCellTiter96 One Solution Cell Proliferation assay kit（Promega, Madison, WI, USA）を用いて決定した

2.11. RNA Isolation and Real-Time PCR

Total RNAをFavorPrep Total RNA Purification Kit (Favorgen Biotech, Pingtung, Taiwan) を用いて分離し、High Capacity RNA-to-cDNA kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) を用いてcDNAを逆転写させた。 希釈したcDNAをPower SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems) とiNOS、COX2、またはGAPDHに特異的なプライマー2 pmolと混合した。 cDNA の増幅は、StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems) を用いて実施した。 95℃で10分間の初期熱変性後、PCR条件を95℃15秒、60℃1分とし、40サイクルで行った。 各PCRについて、逆転写を行わない対応するmRNA試料を陰性対照として含めた。 cDNAコピー数の定量は、標準曲線を用いて行った。 統計解析

データは平均標準誤差（SEM）として表示された。 グループ間の差を比較するために、両側スチューデントのt検定または二元配置分散分析を適用した。 統計解析の結果、複数群間の差が有意であった場合、Tukey post hoc testを使用してさらに比較を行った。 すべての統計解析は、IBM SPSS 22.0版ソフトウェア（IBM, Chicago, IL, USA）を用いて行った。 2460>

3. 結果

3.1. AME中のAtractylenolide IとAtractylenolide IIIの含有量

既知の品質管理マーカーの中で、Atractylenolide IとAtractylenolide IIIはin vitroで抗炎症化合物として検証されている 。 AMEからの酢酸エチル画分は，真正標準物質をスパイクして投入し，保持時間と紫外可視スペクトルのパターンを比較することで暫定的に同定した。 HPLCクロマトグラムをFigure 1に示す。 AME中のアトラクチレノライドIおよびアトラクチレノライドIIIの含有量は、それぞれ0.0338 mg/g抽出物および0.565 mg/g抽出物であった。

(a)

(b)

(c)

(d)

である。
(a)
(b)
(c)
(d)

図1

Atractylodes macrocephala water extract (AME) HPLC chromatograms of a.。 (a, b)標準マーカー。 (c, d) AME.

3.2. AMEの経口投与がマウス腹膜滲出液細胞におけるScavenger Receptor発現に及ぼす影響

thioglycollate の腹腔内注射は、実験室で無菌性腹膜炎を誘発しマウスから腹膜マクロファージを濃縮するのによく使用されている。 腹膜マクロファージの大部分は血中単球に由来する。 我々は、この方法を用いてAME投与マウスの腹膜滲出液を採取した。 マクロファージのマーカーとしてCD11bを使用した。 単球からマクロファージへの分化過程では、SRA、CD36、LOX-1などのスカベンジャー受容体の発現が上昇するため、これらのタンパク質の発現を調べた。 SRA、CD36、LOX-1はCD11b(+)細胞でのみ発現していた（Figure 2(a)-2(c)）。 対照群におけるSRA(+)CD11b(+)細胞の割合は66%であったが、AME 500 mg/kgおよび2,500 mg/kg投与によりこの集団はそれぞれ69%および76%に有意に増加した。 対照群におけるCD36（+）CD11b（+）およびLOX-1（+）CD11b（+）細胞集団の頻度はそれぞれ95％および14％であり、AMEは両細胞集団に有意な変化を与えなかった。 SRA(+)CD11b(+)細胞集団の増加は、AMEがthioglycollateに反応して血液単球のマクロファージへの分化を刺激することができることを示している。

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

3.3. LPS刺激マクロファージにおける表面CD86発現に対するAMEの経口投与の効果

マクロファージ上のCD86などの共刺激分子は、マクロファージとTh細胞間のクロストークを強化するために必要である 。 AME投与マウスから分離した腹腔マクロファージをLPSで24時間刺激し、フローサイトメトリーでCD86の膜発現を測定した。 LPSによる刺激で、CD86の平均蛍光強度は5.24から11.24に増加した（図3）。 500 mg/kg群および2,500 mg/kg群におけるCD86の平均蛍光強度は、それぞれ10.14および10.59と有意に減少した。 これらの結果は、AMEがマクロファージとTh細胞の相互作用に影響を与える可能性を示している。

(a)

(b)

(a)
(b)

3.4. マクロファージおよび血清の炎症性サイトカイン反応に対するAMEの経口投与の効果

まず、AMEの経口投与がマクロファージの炎症反応に影響を与えるかどうかを調べた。 対照群またはAME高用量群の腹膜マクロファージをLPSで24時間刺激し、上清中のTNF-αおよびIL-6の産生量を測定した。 TNF-αの分泌量はコントロール群とAME群で差がなかったが、IL-6の分泌量はAME群で増加した（図4（a））。 また、LPSで刺激した細胞では、AMEはiNOSおよびCOX-2遺伝子の発現に変化を与えないことがわかった（図4(b)）。 次に、AME投与マウスの腹腔内LPS刺激に対する全身反応について検討した。 AMEは、TNF-αおよびIL-6の血清レベルをそれぞれ20%および47%低下させた（図5）。 これらの知見は、AMEの抗炎症活性がマクロファージの調節とは無関係に起こる可能性を示している。

(a)

(b)

(a)
(b)

LPS 腹腔内注入後の血清炎症反応に対するAMEの経口投与による影響。 AME（2500mg/kg）を10日間マウスに経口投与した。 LPS（1.3mg/kg）腹腔内注射の1時間後に血清を採取し、ELISA法によりTNF-αおよびIL-6の血清濃度を測定した。 データは平均値±SEMを表す(n=10)。 (-): LPSなし、(+): LPS処理。 # P＜6631＞0.001対コントロール（-）、P＜6631＞0.05、P＜6631＞0.001対コントロール（＋）＜2759＞＜2759＞＜7669＞3.5． AMEの経口投与が脾臓のT細胞およびB細胞集団とMHC II発現に及ぼす影響

AMEの経口投与が適応免疫細胞を変化させるかどうかを調べるために、コントロールとAMEグループの脾臓のCD4およびCD8 T細胞およびB細胞のパーセンテージを分析した。 CD4(+)T細胞は500mg/kg群、2,500mg/kg群でそれぞれ23.4%から27.2%、26.9%と有意に増加した（図6（a）、図6（d））。 CD8 T細胞およびB細胞集団には差が認められなかった（図6（a）、（b）、（d））。 MHCクラスII分子は、CD4 T細胞への抗原提示に必要である。 マウスMHCクラスII分子IA/IEの脾臓発現を解析したところ、MHC II分子の平均蛍光強度は2500mg/kg AME群で65.3から68.9に有意に増加した（図6（c）および図6（e））。 これらの知見は、AMEが適応免疫系の変化を誘発することを示唆している。

(a)

(b)

の場合
(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

図6

脾臓における適応免疫系の構成に対するAMEの経口投与の効果。 コントロール群またはAME群から脾臓細胞を分離し、FITC標識抗CD4抗体およびPE標識抗CD8抗体（a）、FITC標識抗CD19抗体（b）、またはFITC標識抗MHC II抗体（c）で二重染色し、フローサイトメトリを用いて評価した。 (a-c)代表的なドットブロットまたはヒストグラムを示す。 (d-e) バーは平均±SEMを示す（n=6）。 P <0.001 vs control.

3.6. AME経口投与による脾臓細胞のT細胞増殖およびTh1/Th2サイトカイン反応への影響

AME投与後の脾臓T細胞の機能を調査した。 対照群またはAME群から分離した脾臓細胞を、抗原受容体特異性に関係なくT細胞全体が活性化するマイトジェンである抗CD3抗体で刺激し、脾臓細胞の増殖を調べた。 抗CD3抗体で48時間処理すると、MTSアッセイで測定した光学密度が2.6倍上昇した。 抗CD3抗体による増殖は、対照群とAME群の間で差がなかった（図7（a））。 IFN-γおよびIL-4は、それぞれTh1細胞およびTh2細胞の代表的なサイトカインである。 抗CD3抗体で刺激した脾臓細胞におけるIFN-γおよびIL-4の分泌を評価した。 AME 500 mg/kg群ではIFN-γ分泌の有意な減少が認められたが、2,500 mg/kg群ではIL-4分泌が有意に増加した（図7（b））。 用量依存的な作用は認められなかったが、AMEはTh2反応を促進する傾向が認められた。

(a)

(b)

(a)
(b)

Figure 7

活性化脾臓T細胞の増殖とサイトカイン分泌に対するAMEの影響。 コントロール群およびAME群から分離した脾臓細胞を培養し、抗CD3抗体（2μg/ml）で48時間刺激した。（a）脾臓細胞の増殖反応は、MTSアッセイを用いて決定された。 (b）刺激48時間後のサイトカイン分泌量をELISA法により測定した。 棒グラフは平均±SEMを表す（n＝6）。 (-)：抗CD3抗体なし、(+)：抗CD3抗体処理。 # P <0.001 vs control (-), P <0.05 vs control (+).

4. Discussion

漢方では気を高めるハーブは免疫系の強化が期待されます。 本研究では、特にAMEを経口投与したマウスから分離したマクロファージとT細胞の炎症反応に着目した。

チオグリコール酸誘導無菌性腹膜炎は1964年にGallilyらによって初めて紹介され、以来、初代マクロファージの分離に最もよく使われる方法となっている 。 チオグリコール酸を腹腔内に注射して4日目には、腹膜滲出液の総細胞数は約5倍に増加する 。 これらの細胞のうち、マクロファージが優勢であり、好酸球がそれに続く。 チオグリコール酸注入マウスで増加した腹膜マクロファージは、骨髄由来の血球単球が原因であると考えられる。 単球からマクロファージへの分化の過程でスカベンジャー受容体のアップレギュレーションが起こる。 スカベンジャー受容体はマクロファージ自然免疫受容体の一種で、ポリアニオン性リガンドを特異的に認識し、貪食作用に関与している . 我々は、CD11bといくつかのスカベンジャー受容体マーカーを用いて、腹膜滲出液細胞中の単球由来マクロファージを同定し、CD11b（+）SRA（+）細胞集団が、AME群で有意に増加していることを見出した。 このことから、AMEの投与はチオグリコール酸に反応する血中単球のマクロファージへの動員・分化を促進することが示唆されました。

LPSはtoll-like receptor (TLR)-4/MD-2 complexによって認識されています。 TLR4は2つのアダプター分子、MyD88とTRIFを介して炎症反応を誘導する。 MyD88依存性のシグナル伝達経路はNF-κBとマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）を活性化し、TNF-αやIL-6などの炎症性遺伝子を誘導する。 TRIF依存性シグナル伝達経路は、インターフェロン制御因子-3を活性化してIFN-βを産生し、コスティミュレーション分子のアップレギュレーションに必要である . TRIFシグナル伝達経路はまた、NF-κBとMAPKの活性化にも関与するが、MyD88依存性経路に比べると遅れて活性化される。 コスティミュレーション分子のアップレギュレーションはTRIFのみに依存し、炎症反応はMyD88とTRIFに共依存している。 AMEグループのマクロファージでは、試験した炎症マーカーに対する抑制効果はなかった。 その代わり、CD86の発現が減少していた。 マクロファージ上のCD86はTh細胞上のCD28と結合し、Th細胞の活性を強化する。 この結果は、AMEの経口投与は、マクロファージにおけるNF-κB-およびMAPK依存性の炎症反応には影響を与えず、CD86の発現につながるTRIF依存性の経路のみを特異的に阻害することを示している。 AMEがマクロファージとTh細胞が優勢な病的状況において変化を引き起こすかどうかを評価するために、さらなる研究が必要である。

LPS刺激マクロファージ系は、天然物または薬剤候補の抗炎症活性を評価するための非常に一般的なin vitroモデルである。 このモデルを用いると、脂溶性成分は細胞膜を容易に透過するため、目的の結果を得ることが容易である。 我々のデータは、AMEを経口投与したマウスから単離した腹膜マクロファージが生体外で抗炎症作用を示さないことを示し、以前に報告されたin vitroの結果とは矛盾するものであった 。 一方、AMEの抗炎症活性は、LPSの腹腔内注射に伴うTNF-αおよびIL-6の血清反応に観察された。 この全身的な抗炎症活性は、マクロファージの調節によってもたらされる可能性が最も高い。 in vivoとin vitroの条件の違いの1つは、in vivoではLPSはいくつかのリポタンパク質によって循環中に運ばれ、肝細胞によって除去されるが、in vitroではこのイベントを模倣できないことである 。 LPSのクリアランスは、肝マクロファージの過剰な刺激を防ぐことができる。 AMEの全身的な抗炎症作用が肝臓でのLPSクリアランスと関連しているかどうかは、まだ解明されていない。 同様の結果が、ハトムギ水抽出物を経口投与したマウスから単離した腹膜マクロファージでも得られている（未発表データ）。 Astragalus membranaceusとAMは、同じ氣質改善ハーブのカテゴリーに属します。 現時点では、マクロファージの変調を伴わないin vivo抗炎症活性が、これらの薬用植物に特有のものか、それとも気の整った薬用植物によって誘導される共通の性質なのかは不明であり、結論を出すためには、さらにデータを蓄積する必要がある。 また、Liらは、AMから単離されたポリアセチレン化合物の一種であるatractylenolide Iと14-acetoxy-12-senecioyloxytetradeca-2E，8E，10E-trien-4，6-diyn-1-olは膜結合型グルココルチコイド受容体と相互作用する分子構造を持っていると報告し ………………………………………………. 彼らの研究によると、抗炎症作用を示すのに必要な最小用量は、アトラクチレノライドIの経口投与300 mg/kgとポリアセチレンの経口投与30 mg/kgであった。 AME2,500mg/kgに含まれるアトラクチレノライドIの量は0.097mg/kgと、必要最低量をはるかに下回る量である。 さらに、AMEの調製過程でポリアセチレンが失われた可能性がある。 AMEには未確認のグルココルチコイド様化合物が含まれており、それが全身的な抗炎症活性に寄与している可能性があります。

適切な免疫反応を維持するには、十分な数のT細胞が必要とされます。 正常な状態では、胸腺でのナイーブT細胞の生成と、末梢のナイーブT細胞およびメモリーT細胞のターンオーバーによって、総T細胞数が維持されています。 マウスとヒトは加齢に伴い胸腺が萎縮し、それに伴いナイーブT細胞の生産量が減少する。 しかし、ナイーブT細胞の維持という点では、マウスは生涯にわたってナイーブT細胞を生産するのに対し、成人したヒトは末梢のナイーブT細胞の分裂によってこの集団を維持する . さらに、マウスのナイーブT細胞の寿命は、ヒトのそれの40倍も短い。 メモリーT細胞は、断続的な分裂によって維持されている。 ナイーブT細胞とメモリーT細胞の正確な生存と恒常的な増殖のメカニズムは完全には解明されていないが、TCR/MHC複合体からのシグナルとIL-7やIL-15などのサイトカインが関与している ………このように、ナイーブT細胞とメモリーT細胞の生存と恒常的な増殖のメカニズムは、まだ解明されていない。 ワクチンの効果を長持ちさせるにはメモリーT細胞が必要であり、リンパ球減少症の治療にはナイーブT細胞が必要である。 AME投与により増加した脾臓CD4 T細胞集団がナイーブCD4 T細胞からなるのかメモリーCD4 T細胞からなるのか、我々は決定していない。 AMEに反応する細胞分画の詳細な特性は、AMEの適用に適した状況を特定するのに役立つだろう。

注目すべきは、脾臓におけるMHCクラスII分子の同時アップレギュレーションがAME群で発生したことである。 MHCクラスII分子は、CD4 T細胞に抗原を提供するために必要である。 我々は日常的に、脾臓のMHCクラスII発現細胞の大部分はB細胞であり、残りの細胞はマクロファージと樹状細胞であることを発見している。 AME投与後、どの種類の細胞がMHCクラスII分子のアップレギュレーションを示したかは明らかにしなかった。 それにもかかわらず、脾臓におけるCD4 T細胞数およびMHCクラスII分子の発現の両方が増加したことは、AMEの補充がCD4 T細胞の全身的な維持に寄与していることを示唆している。 生理的条件下でのIL-4の役割は、B細胞の生存と増殖を促進することによって抗体反応を強化し、蠕虫感染に対する防御を提供することである。 AME群の脾臓細胞は、ex vivoでのT細胞活性化時にIL-4産生の増加を示し、同時にIFN-γ産生の減少を示した。 これらの結果は、通常の条件下では、AMEがTh2反応を促進することを示唆している。 一方、AM 由来の糖タンパク質を経口投与すると、アレルギーモデルにおいて Th1 反応が促進され、Th2 反応が減少することがわかった。 この化合物がAMの全活性を表しているかは不明である。 AMEが病的なTh2反応を防ぐか悪化させるかについては、さらなる研究が必要である

5. 結論

本研究では、AMEの経口投与により、正常マウスのマクロファージとT細胞の反応に変化が見られた。 AMEはチオグリコール酸による腹膜の単球分化を促進し、LPSによる血清中のTNF-αおよびIL-6濃度を抑制した。 これらの全身的な抗炎症作用とは異なり、AME群から分離したマクロファージでは、コスティミュレーション分子の発現の変化を除き、抗炎症作用は認められなかった。 AMEはまた、CD4 T細胞数およびMHCクラスII分子の発現を増加させ、Th1応答よりもTh2応答を促進することにより、適応免疫系に影響を及ぼした。

略語

DW:

Data Availability

本研究の結果を裏付けるために使用したデータは、要請に応じて対応する著者から入手できます。

Conflicts of Interest

著者は利害の衝突がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、教育省が出資する韓国国立研究財団を通じて基礎科学研究プログラムの支援を受けた（2014R1A1A2055052）

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