1.43.2 The Case for Superresolution Microscopy Techniques
Light Microscopeにおける横と軸の分解能は、Ernst Abbeが1873年に述べたように、光の波長と撮影に用いる対物レンズの絞り、つまり受け入れ角の関係における根本的に回折制限があるものです。 この分解能の限界は、横方向で約200nm、軸方向で約500nmと言われています。 光学顕微鏡の回折限界は、結像に用いられる光学系の基本的な限界に由来する。 解像度の低い球状の光源によって形成される像を考えてみると、完全に補正された収差のない顕微鏡光学系から得られる像でさえ、単純な球で記述できないことがわかります。 実際には、焦点位置で複雑な3次元強度分布が観察され、この3次元強度分布は点広がり関数（PSF）で数学的に記述することができる（図1）。 PSFの中央の最大値は、利用可能な全エネルギー強度の86.5%を含んでいる。 横方向と軸方向の両方において、残りのエネルギー強度は回転対称に一連の極大と極小にマッピングされる。 隣接する画像特徴からのPSFの相互作用が、最終的に光学顕微鏡の回折分解能の限界を決定するのである。 理想的な点広がり関数のXY（a）とXZ（b）の強度マップ。
空間的に二つの物体が接近すると、そのPSFは重なり合い、すぐに二つの物体は互いに識別できなくなる。 2つのPSFの最小の重なりは、2つのPSFの間で強度が約25%低下する点であると説明されている。 この強度低下が起こるポイントは、PSFの中央の最大値と最初の最小値の間の距離に相当する。 最小値を正確に配置することが困難であるため、この距離を正確に決定することは非常に困難であり、代わりに、PSFの中心最大値の全幅半値（FWHM）を使用する。
横xy次元において、PSFのFWHMは、式
軸方向xz寸法では、PSFのFWHMは式
から、横および軸分解能は光を集める光学系の数値開口と光自体の波長に依存していることが分かる。 解像力の向上は、高開口数の対物レンズを使用することと、光の波長を短くすることで得られる。 その他、2つの物体の相対的な明るさ（コントラスト）などが、この最小解像距離に影響する。
分解能を上げるために照明の波長を紫外域まで下げると、蛍光プローブの選択肢が狭まり、光学補正や顕微鏡の光路の透過特性の限界も出てきます。 さらに、ライブセル研究において紫外線照明を使用すると、多くの研究者がこの波長が長期的な細胞の生存率に悪影響を及ぼすことを指摘している。 現代の光学設計はレンズの開口数を向上させたが、この点に関する真の改善は、エキゾチックなマウントメディアとカバーガラス材料の使用によってのみもたらされた。
生物学的共焦点顕微鏡は、ピンホール開口を使用して、焦点の外れた物体平面からの迷光を効果的に除去して焦点内のコントラストを改善し、細胞の構造-機能関係の研究における標準的なイメージング手段となっている。 ピントが合った像面の可視化が改善されることで、装置を臨界調整したときに、より容易に実用的な回折限界の解像度を達成することができる。 理論的には、ピンホール開口部が1エアリーユニット以下であれば、横方向および軸方向の解像度は、広視野顕微鏡の場合の1.4倍の限界まで実際に向上する。 しかし、実際には、ピンホール径が1Airyユニット以下では、焦点内発光の多くが不要な焦点外発光とともにピンホールではじかれてしまうため、生物学的イメージングには光が少なすぎる。 生物学的イメージングでは、通常、発光信号を得るのに苦労するため、わずかな解像度の向上のために、この限られた信号の一部を除去することは現実的でありません。 実際、試料からの発光信号が限られている場合、光学スライスの厚みを大きくしてでも多くの信号を集めるために、通常、ピンホールを1エアリーユニットより大きな直径に開けることが選択される。 このピンホール径では、共焦点顕微鏡の分解能は従来の広視野蛍光顕微鏡のそれと本質的に同じである
分解能の限界よりも小さな物体を検出できないということではなく、単一分子のレベルでの検出も可能であり、最新の検出器技術を使えば比較的簡単にできる。 暗視野顕微鏡では、対物レンズに入る直接光を完全に除去することで、微小管（直径25 nm）のような回折限界のある物体で散乱するわずかな光さえも容易に観察できるよう、優れたコントラストを作り出している。 また、蛍光顕微鏡では、回折限界以下の大きさの物体を観察・記録できる優れたコントラスト条件が得られる。 全反射蛍光（TIRF）顕微鏡では、エバネッセント近接場光エネルギーを蛍光体の励起に利用し、軸方向の励起を液体とカバーガラスの界面の数百ナノメートルに限定することで、標準的な広視野蛍光顕微鏡よりコントラストを向上させることが可能である。 この条件下では、非常に薄い光学切片の中で、1分子の移動度さえも経時的に追跡することが可能である。 しかし、暗視野顕微鏡も TIRF 顕微鏡も光学系の解像度を向上させるものではなく、どちらの手法も、サブ解像度での検出を可能にするために、関心のあるオブジェクトと背景との大きなコントラスト差に依存しています。 光学顕微鏡からより細かいディテールを解像する能力を向上させることによる利点は明白である。 解像度が上がれば、細胞の正常・異常な生理・行動の基本となる分子組織をより正確に構造記述することが可能になる。 分子生物学的、生化学的な解析では、接着斑に見られるような機能的組織の複雑さを明らかにするには限界がある。 このような機能的組織を分子レベルの分解能で直接可視化できれば、分子の相互関係や機能的・生理的状態に関連した組織の変化に関する理解が大幅に深まる。 近年、多くの研究者が、従来の横方向および軸方向の分解能の限界を大幅に（2〜10倍またはそれ以上に）向上させるためのいくつかの異なる戦略を利用している。 これらの技術は、試料の照明の変化に依存するものと、超解像画像を構築するために時間軸とともに単一分子検出戦略を使用するものという 2 つの一般的なカテゴリに分類される。 この特定の基準を用いて後述する方法を選択することは、決して、文献に紹介されている他の技術に対するこれらの技術の支持として解釈されるものではない。 この急速に変化する分野でさらなる研究が進めば、新しい手法やアプローチが以下に説明するものを追い越すかもしれない。 しかし、これらの商業的な装置が市場に導入されたことで、様々な分野の生物学者が超解像法を自分たちの特定の生物学的問題に適用することが可能になり、これらの方法を専門の開発研究室から持ち出すことができるようになったのである。 読者は、参照された論文の多くに付随するオンライン補足資料に含まれる高画質の画像を自分で調べることをお勧めする
。