BRAF in Melanoma: ESMO Biomarker Factsheet

Definition of BRAF

BRAF (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1) is serine/threonine protein kinase that plays critical role in RAS-RAF-MEK-ERK mitogen activated protein kinase (MAPK) cell signalling pathway. この経路の活性化は、リン酸化のカスケードを通じて細胞外のシグナルを細胞内に伝達し、正常細胞および形質転換細胞の遺伝子発現、細胞増殖、生存、分化を変化させる。 BRAFの点変異は、広範な固形腫瘍と血液悪性腫瘍のサブセットで同定されており、特にメラノーマに多く見られます。 BRAFの変異の多くは、キナーゼの活性化ドメイン内で起こり、受容体チロシンキナーゼやRASによる上流の活性化とは無関係に、BRAFの構成的活性化とMEKのリン酸化をもたらす。 これにより、ERKの無反応かつ構成的な活性化が生じ、細胞増殖の促進やアポトーシスの回避、ひいては新生物形質転換につながる。 最も一般的なBRAF変異は、BRAF変異型腫瘍の90％以上に認められ、キナーゼ活性化ドメインのアミノ酸600のバリンをグルタミン酸に置換したもの（V600E）である。

BRAF Mutations in Melanoma

BRAF 活性化変異は、すべてのメラノーマの約50％に存在する。 これらの変異の約90％はアミノ酸600で起こり、その大部分はBRAF V600E変異である 。 メラノーマにおけるBRAF変異の高い頻度は、このがん遺伝子が魅力的な治療標的である可能性を示唆しており、進行メラノーマに対する標的治療の新時代をもたらした。

メラノーマの予後バイオマーカーとしてのBRAF

BRAF阻害剤が承認されるまで、BRAF変異メラノーマ患者は野生型BRAFを発現する患者よりも予後が悪いと言われていました。 多くの研究により、転移性黒色腫患者において、BRAF変異の存在と、初回転移の診断または転移巣の切除からの予後不良との関連性が示されています。 しかし、BRAF遺伝子変異の有無は、最初のメラノーマの診断から最初の遠隔転移までの無病期間には影響を与えないようである。 BRAF陽性黒色腫の患者は、診断時に野生型黒色腫の患者よりも若く、生存率が低い傾向があります。 転移性疾患の特定の臨床的特徴はまだBRAF変異の状態と相関していないが、BRAF変異体の原発性黒色腫は、部位（体幹）、発症の早期年齢、および周囲の皮膚に慢性日焼け障害がないことなどの特定の臨床病理学的特徴と関連している …

メラノーマの予測バイオマーカーとしてのBRAF

BRAF変異メラノーマでは、BRAF V600変異の有無が奏効予測バイオマーカーとして注目され、BRAF標的治療が著しい効果を示している。 欧州では、BRAF V600変異を有する切除不能または転移性黒色腫の成人患者の治療薬として、2種類のBRAF阻害剤（vemurafenibおよびdabrafenib）および1種類のMEK阻害剤（trametinib）が承認されています。 これらの標的治療薬による BRAF 変異メラノーマ患者の治療は、この分子変化に伴う予後不良を逆転させました。 BRAF阻害剤であるベムラフェニブとダブラフェニブは、BRAF V600変異を有する細胞においてBRAF活性と下流シグナルに特異的に結合し、これを抑制する。 臨床試験において、これら2つの化合物は、BRAF V600変異を有するメラノーマ患者において深い臨床効果を示し、標準治療の化学療法と比較して、無増悪生存期間および全生存期間を有意に延長した。

MEK吸入薬のトラメチニブは、非リン酸化MEKに結合し、RAF依存性のMEKリン酸化と活性化を阻害する。 臨床試験では、ベムラフェニブやダブラフェニブほどの全奏功率は得られなかったものの、トラメチニブは標準的な化学療法と比較して無増悪生存期間と全生存期間を改善することが示された。 BRAF阻害剤の前治療で進行した患者にはトラメチニブの臨床活性がないことを示す証拠があるが、最近の臨床試験データでは、ダブラフェニブとトラメチニブの併用療法は、どちらかの薬剤の単独療法と比較して、副作用を悪化させずに効果を改善することが示されている。 この併用療法は、BRAF V600変異を有するメラノーマ患者の治療としてFDAによって承認されています。

BRAF変異メラノーマ患者におけるこれらの標的療法の成功は、転移性または切除不能メラノーマ患者が、治療の意思決定を助けるために、転移病巣または原発腫瘍のいずれかのBRAF V600変異をスクリーニングすることが望ましいという推奨につながっています。

BRAF阻害剤に対する耐性

BRAF変異黒色腫患者の一部は、内在性耐性機構によりBRAFまたはMEK阻害剤による治療が奏効せず、これらの治療法に最初に反応した患者のほとんどが最終的に獲得耐性機構を発症し、疾患が進行している。 抵抗性のメカニズムは複数考えられ、これまでに報告されているメカニズムの多くは、MAPK経路の再活性化を伴うものです。 NRAS 変異と BRAF V600E mRNA のスプライスバリアントは、現在までに確認された共通のメカニズムである。 また、PI3K-PTEN-AKT経路の活性化は、BRAF阻害剤に対する獲得耐性に関与することが示されている。

現在、前臨床および臨床開発中のRAF阻害剤は多数あり、それぞれ、これらの薬剤の効果を制限し得る耐性メカニズムを克服することを目的として異なる特性を有している。

メラノーマにおけるBRAF試験の推奨

ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、トラメチニブは、適切な品質管理を含む認定（認証）機関で行われたバリデート試験によりBRAF V600変異陽性の腫瘍を有する切除不能または転移性のメラノーマ患者に適応されます 。

BRAFV600変異の検出には、変異特異的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）、サンガー配列決定、パイロシークエンス、立体構造解析、高解像度融解解析などの方法が利用可能です。

ベムラフェニブとダブラフェニブとともに、臨床試験への登録資格を評価するために、2つのRT-PCRコンパニオン診断アッセイ（cobas® 4800 BRAF V600 Mutation TestとbioMerieux（bMx） THxID®-BRAF assay）がそれぞれ開発されています。 両検査は、BRAF 変異の検出に関して FDA および CE-IVD の承認を受けており、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）腫瘍サンプルからのゲノム DNA 抽出と RT-PCR アッセイにより、野生型および変異型 BRAF の両方を検出します。 cobas® 4800 テストは、優勢な BRAF V600E 変異を高感度で検出し（FFPE 由来の DNA の野生型配列のバックグラウンドで 5%の V600E 配列まで）、一般的ではない BRAF V600D および V600K 変異も低い感度で検出するように設計されています。 THxID®-BRAF アッセイは、BRAF V600E および V600K 変異を高感度（FFPE 組織から抽出した DNA を用いて、野生型配列のバックグラウンドで V600E および V600K 変異を 5 % まで）で検出し、感度が低ければ、一般的ではない BRAF V600D 変異および V600E/K601E 変異も検出するために設計されています … しかし、ヨーロッパでは、いくつかの異なるCE-IVD法によるBRAF検査が可能です。

品質とタイムリーなBRAF変異検査結果の確保

BRAF阻害剤治療の対象となるすべてのメラノーマ患者について、正確かつ信頼性の高い方法でタイムリーにBRAF変異評価を行い、結果を患者の臨床管理に適切に適用できることが重要であり、そのために、BRAF変異の検査は重要です。

• 検査が要求される患者の経路の時点、
• BRAF変異検査のために選択された患者の段階および臨床的緊急性、
• BRAF変異検査自体の所要時間、
• 治療臨床医への結果の伝達方法によって、臨床医の利用可能性に影響が及ぶ可能性があります。

メラノーマのBRAF状態を解析するために、どの手法とどのアルゴリズムを使用すべきか

BRAF変異を検出するために用いられるすべての手法には利点と欠点があり、どちらを使用するかは、通常、現地の慣習や異なる臨床検査室の経験に基づいています。

適切なコンパニオン診断テストを選択する際に考慮すべきパラメータは、感度、特異度、分析感度の限界、失敗率などである 。

感度と特異度を上げ、失敗率を下げる方法としては、以下のようなものがある。

• 選択した方法を「ゴールドスタンダード」メソッドと比較して徹底的に検証する、
• 技術の感度を高めるために検体のマクロダイセクションを行う、
• DNA劣化による失敗率を減らすためにPCR増幅に小さなアンプリコンを選ぶ、
• ベストプラクティスを適用し外部品質管理に参加してメソッドを継続的に検証する …などがあります。

患者選択

ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、トラメチニブの欧州でのライセンスに基づき、切除不能または転移性メラノーマと診断された患者にはBRAF変異の検査が推奨されます。 欧州のガイドラインでは、転移のない患者の原発腫瘍のBRAF遺伝子変異検査は推奨されないとされている。

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