Clinical and Genetic Heterogeneity of 15q13.3 Microdeletion Syndrome

Abstract

15q13.3 microdeletion is a recurrent CNV, presumably mediated by NAHR between segmental duplications in chromosome 15.3.3. 15q13.3欠失と重複は，知的障害，発作，自閉症，言語・発達遅延，精神神経障害，不完全な浸透性と発現性を示す行動障害など，幅広い臨床症状と関連している。 本研究では、ヘテロ接合体欠失を持つ106名の症候性患者と、過去の研究で報告された重複を持つ21名の患者の評価から構成されている。 解析の結果、異なる主要な症状の発現や身近な出来事について、かなりの異質性があることがわかった。 さらに、8人の新しい患者を紹介する。 Convoluted familiar connectionsは、症状発現の複雑さについて新たな洞察を与えている。 先行研究において、欠失のブレークポイントの性質と正確な位置について異なる意見が述べられている。 ここでは、CHRNA7やCHRFAM7Aではなく、FAM7AやGOLGA8が我々の患者に関するブレークポイント領域として機能することを示す。 欠失の大きさは不均質であるとされている。 しかし、我々は、異なるブレイクポイントだけでなく、セグメント重複による15番染色体のaCGH解析の不正確さも、サイズのばらつきの原因であると推測している

© 2016 S. Karger AG, Basel

Sharpらによって初めて報告された15q13.3微小欠失症候群（OMIM 612002）は、第15染色体の分節性重複（BP3-BP5, BP4-BP5）間のNAHRによって仲介されると推定される再発性CNVである。 15q13.3欠失および重複は、知的障害、発作、自閉症、言語および発達遅延、精神神経障害、不完全な浸透性と多様な発現を示す行動問題など、広範な神経発達障害と関連している。 典型的な1.6MBの欠失は7つの遺伝子を含んでいる。 ARHGAP11B、MTMR10、MTMR15、TRPM1、KLF13、OTUD7AおよびCHRNA7である。 CHRNA7は神経細胞のα7ニコチン性アセチルコリン受容体をコードしており、そのため、発現した臨床的特徴の主要な候補遺伝子と考えられている。 さらに、15q13.3重複の患者1名、BP3とBP5の間に3.4MBの欠失を持つ患者1名について記述した。3欠失は106例、重複は21例である。

最近の研究では、欠失のブレークポイントの性質や正確な位置について異なる意見も出てきている。

Methods

DNA Extraction and Array CGH

DNA源として末梢血白血球を使用した。 アレイCGH解析は、アレイスライドSure Print 4x180K (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif., USA)を用いて実施した。 患者DNAはCy3、参照DNAはCy5で標識し、Cot-1 DNA (1.0 µg/ml)を用いてハイブリダイゼーションが行われた。 テスト DNA サンプルは、性別を一致させたリファレンス DNA (Agilent) とハイブリダイズした。 精製、ハイブリダイゼーション、洗浄の各ステップは、製造元の説明書に従って実施した。 Sure Scan microarray Scanner G2600D (Agilent), Feature Extraction software (Agilent) and Agilent Cytogenomics Software Edition 2.0.6.0 を使用。

FISH and Breakpoint Analysis

培養末梢リンパ球のメタフェースのスライドは-70℃で保管されていました。 ハイブリダイゼーションの前に、スライドはアルコールシリーズ（70、80、100％）で処理され、その後ペプシン処理（15分、37℃）が行われた。 蛍光標識BAC（Illumina®, BlueFish）をFISHプローブとして使用した。 プローブ調製、ハイブリダイゼーション、洗浄工程はイルミナの説明書に従って行った。

BAC probes used were RP11-11H9, 22,067,176-22,300,706、chr.15q11.2; RP11-40J8, 30,546,758-30,724,265, chr.15q13.2; RP11-348B17, 31,281,641-31,502,115, chr.15q.13.3; RP11-265I17, 32,293,149-32,457,541, chr.15q13.3; RP11-280K19, 32,654,212-32,821,799, chr.15q13.3, および RP11-232J12, 53,792,861-53,948,902, chr.15q21.3（図1、hg19参照）。

結果

臨床評価

患者は当初、知的障害および/または発達遅延のために神経小児の診察に際し観察された。 表1に細胞遺伝学的所見と臨床所見をまとめた。

患者の説明

患者1 (III/1)

13歳の少女は注意欠陥多動障害（ADHD）、知的障害、発達遅延、呼吸器感染症の再発、側湾を呈した． 体重と頭囲（OFC）はそれぞれ10パーセンタイル（P）、P90前後で推移している。 彼女は特別支援学校に通っている。 母親（図2のII/2）も特殊教育学校に通い、無事に修了した。 両親とも、これ以上の調査は不可能である。 図2

患者2 (III/2)

女性患者は9歳で来院、発達と言語の遅れ、知的障害（K-ABC-Test：IQ63）が見られた。 起床時脳波で全般的な変化を認めたが、今のところ発作は起きていない。 OFCはP3〜P10の間、体重、身長は正常範囲である。 ADHDはメチルフェニデートで治療中である。 明るい性格だが、攻撃的で衝動的な面もあるとされ、特殊学校に通学している。 両親ともこれ以上の調査には応じていない。

患者3（III/3）

10歳の患者は学習障害と診断されたが、これ以上の定義づけはされていない。 この少女の身体測定は時間的に高い変動を示している。 2歳までOFCはP<3であったが，現在ではP97である。 患者4（III/6）

この患者（13歳）の検査では、言語と精神運動機能の遅れに加え、軽度の知的障害（HAWIK-IV：SW 56）が認められた。 顕著な特徴は多発性ジスラリアとADHDであり，メチルフェニデート（10〜15mg/日）で治療している。 脳波は異常なし、OFCは正常、身長はP90、体重はP97である。 患者の性格は、友好的であるが、時に攻撃的で衝動的であると言われている。 本人は養護学校に通学している。 両親はともに養護学校に通っていた。 父親（II/5）は傷害罪で服役中。 妹2人（III/7、III/8）も養護学校に通っており、異母兄（III/9）は発達と言語の遅れを示しているが、欠失はない。 この患者は、患者1、2、3のいとこである。 両親の調査はできていない。

患者5

この患者（14歳）は、異常な社会的行動とADHDを呈示した。 学業成績が悪く，知的成績（HAMIK-IV，IQ78）と家族の平均値との間に乖離があったため，受診を開始した。 てんかん発作の後、オルフィリル®による治療が奏功している。 ADHDはメチルフェニデート（5-10mg/日）で治療中。 6997>

患者6

患者6は乳児期に発達障害と言語障害を呈した。 彼は低緊張の徴候を示した。 診察時，19歳の患者は知的障害とADHDを呈していた。 メチルフェニデートによる治療は，患者がハイパフォーマンススポーツを始めた後に中止され，ADHD症状の治療に有効であることが判明した。 母親は欠失型キャリアではない． 父親は調査不能。

患者7

患者は7歳で受診し、軽度の知的障害（K-ABC-Test, SW: 63）が認められた。 体格はすべてP10以内である。 落ち着きがなく不注意であるとのことである。 特別支援学校に通学している。 両親は調査不能。

患者8

この患者は生まれつき心臓に欠陥（心室中隔欠損と心房中隔欠損）を持っていた。 低位耳、過大視、斜視、低緊張などの異形性を示す。 精神運動発達は遅れている。 体長とOFCはP50、体重はP10であった。 父親から重複遺伝を受け継いだが、父親には目立った表現型はない。 6997>

Breakpoint Analysis

先行研究において，欠失の大きさの不均一性が注目されている． ShinawiらはFAM7A1/2がbreakpointとして機能すると仮定し、SzafranskiらはCHRNA7とCHRFAM7Aが15q13.3遺伝子座の反復欠失に関与していると推測している。 Antonacciらは、GOLGA8という遺伝子ファミリーを候補として挙げている。 これらの説をFISHで検証する試みがなされた。 プローブ4はCHRNA7、プローブ5はFAM7A、プローブ2はCHRFAM7A、プローブ3はCHRFAM7Aから遠位の領域をマークしている（図1）。 我々の患者では、FAM7Aは15番染色体の両方で検出可能である。 この所見は、遠位の切断点がCHRNA7とFAM7Aの間に位置することを示している。 患者7と4の解析から、近位側の切断点はCHRFAM7Aの遠位に位置していることが分かった（図3、4）。 患者7では、プローブ3がブレークポイントを橋渡ししている。 図3

Evaluation of Symptomatic Patients Described in Previous Studies

患者および研究については表2およびオンライン補足資料1参照（すべてのオンライン補足資料については、www.karger.com/doi/10.1159/000443343 参照）。 統計解析は、ソフトウェア「R」を使用し、フィッシャーの正確検定によって行った。 表2

Discussion

我々が紹介する家族は興味深い特徴を示している。 一方では関係の程度が異なり、他方では症状も異なっている（図2）。 しかし，関係性の程度と症状との間に明確な関連はない。 姉妹である2、3の患者さんは、驚くほど違っています。 同じような環境要因にさらされ、同じ欠失の大きさを持っているにもかかわらず、体格、性格、症状の重さがかなり異なっている。 従って、他の遺伝的要因が臨床症状の程度に影響を与えるに違いない。 考えられる説明は、彼女の遺伝子のゲノムにおける発現が変化し、それが多様な影響を及ぼしている可能性があることだ . このアプローチは、Henrichsenらによってさらに確認されている。彼らは、CNV領域はより低く、より可変なレベルで発現し、隣接する遺伝子の発現を修飾することを示している。 Chaignatらは、CNVがマウスの発生過程における遺伝子の発現タイミングを変化させることを述べています。 さらに、個体によって異なる発現の時間的パターンが見られるという。 さらに、同じ神経生物学的経路の異なるステップをコードする異なる遺伝子の発現変化または変異は、神経学的症状を強める可能性があります。 Pootらは，CNVの表現型多変量性につながるさまざまなメカニズム，例えば，CNVの相互作用，遺伝的エピスタシス，対立遺伝子排除などを示唆している。 ADHDの起源は多因子性であるらしいので，1家族に集積があってもおかしくはない。 驚くべきことに，すべての子供がこの欠失の影響を受けている。 特定の家系における遺伝的な組み合わせは、おそらく症状が現れる確率を高める。 さらに、欠失を持つ母親の子宮内環境が、その子供の表現型に影響を及ぼしている可能性もある。 しかし，症状の発現に相関する共有CNVは同定されず，また，我々の患者のいずれにおいても第2の病原性CNVは同定されなかった。

breakpoint analysisによると，遠位切断点はCHRNA7から遠位に位置している。 その位置は、すでに示唆されているように、遺伝子ファミリーFAM7AやGOLGA8内、あるいは遺伝子座の制御領域内である可能性がある。 近位側のブレークポイントはCHRFAM7Aから遠位に位置している。 1家系に属する患者1-4では、aCGH-解析ソフトで検出された欠失の大きさが異なる。 これらの違いは、ブレークポイント領域内およびその周辺のaCGHにおけるオリゴヌクレオチドの分布パターンのギャップによってもたらされる。 このような差異が生じるのは、ブレークポイント領域内およびその周辺におけるaCGHのオリゴヌクレオチドの分布パターンのずれによるものである。 15q13.3の再発性欠失のサイズが明らかに異なるのは、処理ソフトのアーチファクトである可能性が最も高い。 この欠失は家族全員が同じサイズであると仮定する（オンライン補足資料2参照）。

Different CNV studies has revealed a association of the 15q13.3.3マイクロデレエーションと統合失調症、てんかん、自閉症との関係 ブレークポイントや症状を変化させる要因について、新しい症例や理論を提示する出版物がいくつか発行されている。 これらの情報を統合し、新たな関連性を見出すことに努めた。 欠失は80.88%で遺伝する。 Sinkusらは、CHRNA7プロモーター多型が転写レベルを約25％低下させ、母子のコルチゾールレベルに影響を与えることを研究している。 母親だけでなく子供も多型保有者である場合、子供のコルチゾールレベルはさらに低下する。 また、子宮内環境の影響は、他の要因にも影響すると考えられる。 母親から欠失を受け継いだ場合、患者のOFCは低下する（50％でP<25、p = 0.002）。 したがって、母親から異常が遺伝した場合、子宮内周囲で症状が強まることが推測される。 今回の評価では症状のある患者のみを対象としたため、異常の大部分が明らかに母親由来である（54％、p＝0.001）ことが説明できるだろう。 この文脈では、欠失の性別分布が均等であることが印象的である。 我々のデータは、Lowtherらの所見を裏付けるものである。 彼らは15q13.3欠失の包括的なレビューの中で、症候性患者と無症候性患者を組み合わせている。 我々は症候性患者のみを対象としたため、特徴の分布パターンの比率は似ているが、相対的な数は異なる。 欠失の母方のディセントが増加することについては，男性の生殖適性の低下が考えられると述べている

欠失の大きさは症状の程度と一貫して相関していない。 例えば、知的障害の程度を欠失の大きさと比較すると、直線的な関連は見られない。 典型的な1.6MBの欠失を持つ患者は，それより小さいまたは大きい欠失を持つ患者よりも重度の障害を示すことが多い（41.07％，p＝0.00045）。 知的障害は重複よりも欠失の患者において有意に多く報告されている（79.78％と55.56％、p = 0.037）。 予想通り，正常な知能は欠失＜4736＞1Mbの患者で最も多く報告された（45％，p＝0.0037）。

サイズ1-1.6Mbの欠失は最も頻繁に起こる（63.21％, p＝0.0002）． 重複は<1Mb(66.67%, p=0.0004)が最も多く記載されている。 欠失については、知的障害（79.78%）、言語障害（75.34%）、両親の顕著な表現型（66.67%）、行動障害（63.64%）が、てんかん（30.61%）や自閉症（27.71%）よりもはるかに多く記述されている（p = 0.02-3.931E-09）。 重複と欠失を比較すると，重複は自閉症との関連が多く（p＝0.039），両親の表現型は顕著に少ない（p＝0.027）＜6997＞＜4864＞てんかんは軽度の知的障害と有意な関連がある（59.09％，p＝0.0029）。 言語障害は79.24％の症例で知的障害と関連している（p＝0.003）

結論として，微小欠失15q13.3の臨床表現型は多因子性由来であると言える。 同じような環境因子にさらされた近親者であっても，その臨床症状は大きく異なる。 15q13.3微小欠失または顕著な微小重複を有する家族における遺伝カウンセリングは、このように複雑で、時に不適切な場合がある。 6997>

Acknowledgement

著者らは，フライブルク人類遺伝学研究所細胞遺伝学グループのMargot Fliegauf，Monica Heinkelein，Helga Heitzler，Claudia Ladwigが実験的助言と援助を行ったことに感謝している． また、Ekkehart Lausch, Elke Botzenhart, Susanne Munk-Schulenburg, Andreas Buscheには、患者のケアに感謝する。 6997>

Statement of Ethics

The authors have no ethical conflicts to disclose.

Disclosure Statement

The authors have no conflicts of interest to declare.

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