Clonogenic assay: What, Why and How

A clonogenic assay, as colony formation assay

is in vitro cell survival assay. このアッセイは1950年代に初めて報告され、がん細胞の生存と成長に対する放射線の影響を研究するために用いられ、その後放射線生物学において重要な役割を果たしている2

クローン形成能を測定するためには、細胞を非常に低い密度で播種し、コロニーが形成されるまで1～3週間ほど放置する必要がある。 その後、コロニーを固定し、クリスタルバイオレットで染色して可視化し、数を数えます。 データの解析には、細胞の生存曲線をプロットする。 今日、クローン形成アッセイは、特に癌生物学におけるさまざまな実験的疑問に答えるために使用されている

This blog highlights:

How to perform a clonogenic assay with important considerations to make the way

Using label-free microscopy and confluence detection to assess colony count and size using automated image quantification

The clonogenic survival assay

Clonogenic assay is widely used in the field of cancer research as interpret as the trait of clones form of cancer cells with tumor initating abilities. このアッセイは当初、放射線生物学の分野で使用されていたが、現在では細胞増殖や、臨床応用が期待される様々な薬剤の細胞毒性または遺伝毒性効果を評価する、がん研究の標準的なツールとなっている。 これには、化学療法剤および標的療法の単独または併用が含まれる3.

Clonogenic growthは、特定の細胞集団の幹細胞性を評価するためにも使用されている（幹細胞は、継続的に増殖する可能性を持つ長寿命の細胞であるため）。 これは、がん幹細胞がしばしば化学療法抵抗性、二次腫瘍の形成、およびがんの再発に関連することから、特にがん研究に関連している。 4

クローン形成アッセイは、細胞が長期間にわたって生殖機能を維持できるかを測定します。 これは、時間や、場合によっては数回の細胞分裂を経て発現する表現型効果を明らかにする上で、重要な特徴である。 治療抵抗性を分析する場合、これは特に重要である。 薬剤耐性は、短期間の細胞毒性アッセイでは同定できません5。

How to perform a clonogenic assay

このセクションの情報は、Nature Protocols1にclonogenic assay protocolを発表したFrankenら（2006）から引用し、私の博士課程で60以上のclonogenic assayを行って得られた経験からもいくつかの洞察を加えている。

(1) 細胞を低密度に播種し、その後処理して、細胞のクローン形成能に対する処理の影響を調べることができます。

(2) 細胞を一定期間処理した後、無処理培地で低密度に再播種し、クローン形成能の有無を調べることができる。

後者は、治療後の治療抵抗性を評価するためによく使われる。 図1は、クローン形成アッセイを実行する従来の方法である第1のアプローチをまとめたものである。 これから明らかになるように、これは時間がかかる方法であり、実験の進行に関する情報を提供しない（エンドポイントのみ）。 自動化された方法とエンドポイント以外の代替方法については後ほど説明する。

Traditional protocol for clonogenic assays

Figure. 1｜細胞を播種し、処理し、そしてクローン形成能を評価する、従来のクローン形成プロトコルの概要。

クローン形成アッセイは、通常6ウェルまたは24ウェルプレートで行われる。 孤立したコロニーが形成されるように、細胞はまばらに、そして均一にプレーティングされる必要があります。 したがって、クローン形成アッセイを実施する前に、選択したウェルサイズに対して播種密度を最適化することが重要です。

良い出発点は、文献を調べて、あなたの細胞株でクローン形成アッセイを行った研究があるかどうかを確認し、この播種密度と他の2、3種類の播種密度をテストすることです。 この最適化プロセスでは、コロニーが合体してコロニーの定量や解析に支障が出ないよう、実験のエンドポイント（7日、14日、21日など）や細胞増殖速度も考慮することが重要です。 播種密度は、実験中のすべての処理条件について同じにする必要があります。
正しいコントロールの使用は、解析段階において非常に重要である。 未処理のコントロールとビヒクルのみのコントロール（これはDMSO、PBS、またはあなたの治療法が溶解するどんな溶媒でもよい）を常に使用する必要がある。 処理条件については、多くの場合、希釈系列が使用されます。 処理期間と処理の厳しさによって、濃度範囲を決定することができ、これにはある程度の最適化が必要と思われる。

コロニー形成期には、すべての処理条件下でコロニーの成長を観察する必要があります。 コロニーは50細胞以上とみなされ、顕微鏡でしか見ることができない。 本アッセイは通常長期に渡るため、細胞培地を交換する必要があります。 細胞は最初から非常に低いコンフルエンスにあるため、通常のような定期的な培地交換は必要ありません。 ただし、播種後、薬剤や化合物で処理する場合は、その半減期を考慮し、必要に応じて新たな処理を加えることが重要です。

コロニーの成長を経時的にイメージングすることに興味がある研究者の方へ。 CytoSMART Omniに注目することをお勧めします。

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最も速く成長するのはコントロール条件のコロニーであることが多いため、これらの細胞を実験のエンドポイントの指標として使用できます。 すべての処理条件について、同時に実験を終了させることが重要である。

実験が終了したら、細胞をPBSで穏やかに洗浄し（コロニーを乱さないようにPBSをウェルの横に加える）、固定し、DNAインターカレーション色素であるクリスタルバイオレット（0.5% w/v）で少なくとも30分染色する必要があります。 余分な染料を取り除くのは面倒である。 最良の方法は、余分な染料がすべて除去され、明るい紫色のコロニーだけが残るまで、ビーカーに水を入れてプレートを静かに浸すことである。 染色されたコロニーは、染色後50週間まで数えることができる。 ウェルの高解像度写真を撮影し、分析、プレゼンテーション、出版物の図に使用できます。

研究者によるコロニー形成アッセイの分析と最適化をサポートするために、CytoSMARTは、10倍の倍率でウェルプレート全体の（タイムラプス）画像でコロニーを検出するCytoSMART Omniのアプリケーションを発表しました。 インキュベーターでのタイムラプスイメージングは、エンドポイントではなくキネティックな情報を提供することができ、処理がいつ細胞に影響を与え始めるかについて、より詳細な情報を提供することができます。 ラベルフリーの画像解析は、コロニーの検出、サイズ、円形度の評価に使用されます。 コロニーが結合し始めるタイミングをピンポイントで特定し、それに応じて最適化します。

クローン形成アッセイの解析方法

各処理条件について手動でコロニーを数え、データを生存曲線として表現するのと同じくらい簡単です（曲線には少なくとも3つの生物学的反復を使用する必要があります）。

生存曲線では、処理した細胞の生存率 (SF) (播種した細胞に対して形成されたコロニーの比率を含む) を計算し、処理量に対してプロットすることが必要です。 細胞株によってプレーティング効率が異なるため、SFを計算する前に、細胞のプレーティング効率（PE）を決定する必要があり、これが生存率計算に影響します。

PEとは、無処理細胞で播種した細胞数に対するコロニー数の比率をいいます1。 図1にPEとSFの式と生存曲線の例を示す。

手動でコロニーを数えるのは面倒だし、バイアスがかかりやすいので、クローン形成アッセイの画像を素早く客観的に解析するために、自由に使えるコンピュータ画像解析ツールが多数開発された。 言及に値するのは、Brzozowskaら（2019）が開発した自由に利用できるソフトウェアパッケージで、コロニーを数えるだけでなく、有用な細胞挙動情報の別の層であるそのサイズ分布もプロットします（図2a参照）6

個々のコロニーの計数と定量化の代替案は、コロニーによって覆われているウェル領域の割合（コロニー面積率）を決定してクロノジェニック細胞増殖を定量化することです。 Guzmánら（2014）は、まさにこれを行うColonyAreaという自由に利用できるImageJプラグインを開発しました（図2b参照）7これは、目やコロニー計数ソフトウェアで数えるのが難しいマージしたコロニーがある場合、または迅速かつハイスループットの分析方法を望む場合に役立つツールです

Figure. 2｜自由に利用できるクローン形成アッセイ測定ツール。 (A) Brzozowskaらは、コロニーを数え、コロニーサイズを測定するソフトウェア（countPHICS）を開発した6 (B) Guzmánらは、コロニーの成長面積と染色強度を定量化するImageJプラグイン、ColonyAreaを開発した7。

Label-free, non-endpoint, semi-automated clonogenic assay protocol

Mayerらの最近の論文（2018）では、96ウェルのマイクロプレート形式とコンフルエンス検出を用いてコロニーを測定する、新しい、修正したclonogenic assay protocolについて説明しています。 この方法は、96ウェルプレートを用いた包括的な実験セットアップを可能にし、ラベルフリーで、染色エンドポイントを持たず、解析は半自動で行われる（図3）8。 さらに、同じウェルの時間分解無終点コンフルエンス測定により、半自動解析がコロニー数および平均サイズの決定に適していることが示された。

Figure. 3｜Mayrらは、コンフルエンス検出を用いて、96ウェルフォーマットにおけるクローン原性成長を経時的に評価した8。 グラフは、異なるタイムポイントにおけるクローン形成成長の定量化を示し、画像は、コンフルエンス検出を行った特定のウェルを示す。 緑色のスポットはコンフルエンスリーダーで検出された領域を示し、オレンジ色の矢印は結合したコロニーを示す。

このclonogenic assay法は、標準的なclonogenic assayプロトコルに対して時間およびコスト効率のよい代替法を提供します。 エンドポイントでの固定や染色が不要なこのプロトコルは、クローン形成の成長を継続的にモニタリングし、分析することができます。 さらに、実験中にコロニー増殖のカイネティクスに関する追加的なメトリックスを抽出することもできる。 また、小型化されたフォーマットは、6ウェルや24ウェルプレートに必要な処理量では実現不可能な、siRNAベースやCRISPR/Cas9ベースの治療法などの高価な治療法をテストする機会を開くものである。 最終的に、Mayrらは、コンフルエンス検出によるラベルフリー顕微鏡が、クローン形成能を測定するための堅牢で実行可能なオプションであることを実証した。

クローン形成アッセイのためのラベルフリー、ノンエンドポイント、自動化ソリューションとして、コロニー検出アルゴリズムを搭載したCytoSMART Omniが挙げられます。 コロニー形成は、コロニーカウント、サイズ、円形度の読み出しにより、ウェル全体にわたって時間をかけて測定されます。 細胞はインキュベーターを離れる必要がなく、コロニー形成の過程における細胞の動態情報を得ることができます（図4）。

図4｜CytoSMART Omniを用いた自動コロニー検出。 24ウェルプレート内のHEP-G2肝臓がん細胞は、標準的なCO2インキュベーター内に保管されているCytoSMART Omniを使用して、75時間画像化された。 画像は、コロニー検出アルゴリズム実行後のフルウェルを示し、オレンジ色のコロニーマスクで強調された細胞のクラスターが写っています。 コロニー数、サイズ、円形度はアッセイの期間中測定され、グラフに示されている。

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