Characterization of chemical synthesive TMC and PEG-HA
TMC とキトサンの 1H-NMR spectra を図に示した。 2AではキトサンはH-2の2.68ppmにピークを示し、H-3〜H-6の3.85〜3.55ppmの範囲に複数のピークが見られた。 また、TMCのN-トリメチル基（-NMe3）のピークが3.36ppmに検出され、N-メチル化の存在を確認し、4級化部位を指していることが分かった。 また、一段階N-メチル化によるTMCの製造に伴い、副産物としてNMe2（2.28ppm）を有する修飾キトサン誘導体が合成された。
1H NMRスペクトル キトサンとTMC（A）； HAとPEG- HA（B）.キトサンとTMC（C）.
図2Bに示すように、HAはグルコシドHの3.21 ppmのピークとアセチルHの1.89 ppmのピークを示していた。 OMe-PEG2000-NH2と反応させた後のHAは、OMe-PEG2000-NH2のエチレンHピーク（3.60ppm）と（-NH-CH2-CH2-O-）Hピーク（2.76ppm）を示し、アミドカップリング反応によりPEG-HAが正常に生成したことがわかる（Fig. 2B）。 PEG-HAの他のピークはHAのそれと非常によく似ている。
キトサンとTMCのFT-IRスペクトルをFig.3Aに示している。 TMCは特徴的なピークを示した。 O-H/N-H伸縮(3431 cm-1); C-H伸縮、ピラノース環 (2919 cm-1); C=O伸縮、NH-Acのアミド (1654 cm-1); C-H伸縮、TMCのメチル (1503 cm-1); C-H屈曲、CH3CO (1390 cm-1); C-O-C 伸縮 (1158, 1066 cm-1), と言った特徴的なピークを示した。 図3Aは、キトサンのスペクトルピークがTMCのそれと類似していることを示している。 キトサンは3421 cm-1にO-H/N-H伸縮、2880 cm-1にピラノース環のC-H伸縮、1654 cm-1にNH-AcのアミドのC=O伸縮、1390 cm-1にCH3COのC-H屈曲、1155と1078 cm-1にC-O-C伸縮が見られた。 TMCのメチル基のC-H結合の1503cm-1のピークはキトサンのアミン基へのトリメチル基の付加に対応する。
キトサンとTMC（A）； HAとPEG- HA（B）FTIR spectra of chitosan and TMC（A）の図。
図3Bに示すPEG-HAの特徴的なFTIRピークはO-H伸縮（3428cm-1）、C-H伸縮、ピラノース環（2892cm-1）、C=O伸縮、NH-Ac (1644cm-1) およびC-N伸縮 (1473 cm-1) であった。 HAはPEG-HAと同様の特徴的なピークを示し、HAのスペクトルピークはO-H伸縮（3438 cm-1）、C-H伸縮、ピラノース環（2899 cm-1）、C-O伸縮、NH-Ac（1615 cm-1）であった。 PEG-HAの1473cm-1に見られるピークは、HAとOMe-PEG2000-NH2のアミド結合を示す。
動的粘度分析とチューブインバージョン結果（ハイドロゲルフォーミュレーションの温度応答性）
この研究では、フォーミュレーションの動的粘度値を、85 s-1の固定せん断速度の温度の関数として測定し、温度によるゾル相からゲル相の変換を図4Iに描いている。 没食子酸を担持したハイドロゲル製剤PF127/TMC/PEG-HAおよびPF127の動的粘度（Pa・s）値は、5〜50℃の範囲で温度の上昇とともに徐々に変化し、変曲点から、両製剤は37℃で明らかにゾル-ゲル転移を示すことが確認された。 さらに，両製剤のPF127contentはハイドロゲル製剤の全重量に対して13.5 wt%であり，両サンプルは37 °Cのゲル化温度を示した。 PF127/TMC/PEG-HAおよびPF127ハイドロゲルの37℃における動的粘度値はそれぞれ7.02 Pa.sおよび5.6 Pa.sであった。 PF127/TMC/PEG-HAがPF127よりも高い値を示したのは、PF127ベースのハイドロゲル系にTMCとPEG-HAが加わり、系全体の疎水性が高まってミセル間相互作用が促進されたためである1。 さらに、PF127/TMC/PEG-HAハイドロゲルのゲル化点における動的粘度値が高いことから、応力下での変形に対する抵抗性が高いことが示唆された。 文献によると、PF127はゲル相（37℃）では非ニュートン流体のように振る舞い、動的粘度の値はせん断速度の関数として変化することが報告されている52。 一方，ゾル相のPF127は，ニュートン流体のように振る舞う52． 本研究では，5℃におけるゾル相の製剤の動的粘度値は，PF127/TMC/PEG-HAおよびPF127でそれぞれ0.40 Pa.s および 0.32 Pa.s であり，文献上の既報値とよく一致した52。
チューブ反転法を適用してPF127/TMC/PEG-HAの流動性測定により温度変化によるゲル化の可視化に成功すると，37℃の系ではゾル・ゲル転移による可逆ゲル化も確認された． PF127鎖と他の2つの化合物（TMCとPEG-HA）は、温度をトリガーとして、ポリマー鎖の可逆的な物理的結合によりハイドロゲルを形成する53。 ハイドロゲルは、熱刺激を取り除くと、溶液状態に戻る。 ゲル化温度付近での熱応答性高分子のミセル間凝集は、凝集の正のエントロピー変化（ΔS）と負の自由エネルギー変化（ΔG）を示している54。 水と水の会合は、疎水性効果として知られるエントロピーの増加を引き起こし、これがLCSTにおけるゲル形成の指針となる54。
Rheology study
配合のレオロジーパラメーター、すなわち複素粘度（図5I）、貯蔵弾性率（図5II）および損失弾性率（図5III）を温度の関数として図示してきた。 図5に示すように、すべてのレオロジーパラメータは温度に大きく依存し、グラフの変曲点から得られるように、両方の製剤のゾル-ゲル変換は30℃付近で開始されることが判明しました。 ゲル形成後、両製剤のすべてのレオロジーパラメータは、そのゾル相よりもはるかに高いことが判明した。 PF127/TMC/PEG-HAの複素粘度（I），貯蔵弾性率（II），損失弾性率（III）はゲル状態のPF127よりも著しく高く，TMCとPEG-HAによる修飾PF127ハイドロゲルはPF127ハイドロゲルよりも機械的に強いことが示された。 PF127/TMC/PEG-HAハイドロゲルのレオロジーパラメータの向上は、強いミセル間相互作用に起因すると考えられ、TMCとPEG-HAがハイドロゲル中のPF127が形成するミセルの安定性を高める可能性があると考えられます。 一方、膨潤状態のPF127は15分まで分解に耐え、1時間後に完全に分解した。PF127は酸性条件下ではポリマーと水の相互作用により親水性が増し、ゲル構造の溶解が早くなる21。 また、TMCとPEG-HAを添加することにより、ゲル粒子のpH応答性が改善され、ミセル間相互作用が強化され、酸によるゲル粒子の分解・溶解に対してより長い時間抵抗性を示すようになった
0.1 M PBSを用いて中性pH (7.4) 、30℃下でゲルを膨潤すると、溶解を認めずに4時間ゲルは膨らんだままの状態となった。 4時間後のpH7.4におけるPF127/TMC/PEG-HAの膨潤率（5.01）はPF127のそれ（4.23）よりも高く、PF127/TMC/PEG-HAの相互接続した多孔性ネットワークが膨潤状態でその構造中に多くの水分子を蓄積したことがわかった（図6）。
機械的攪拌下でのハイドロゲル分解研究（機械的安定性試験）
PF127/TMC/PEG-HAおよびPF127をニューラルpH条件下で14日間、機械攪拌（70rpm）してハイドロゲル分解研究を行ったところ、PF127/TMC/PEG-HAはPF127ハイドロゲルと比べて高い程度にゲル分解に抵抗することがわかった（図7）。 PF127/TMC/PEG-HAからなるハイドロゲルは、14日間の機械的撹拌後、45.4%の残存質量を示したが、PF127系は14日後に高い質量損失を示した（39.2%の残存質量）。 したがって、製剤中のPF127ポリマー鎖にTMCとPEG-HAを添加した後、この修飾によってより相互結合したハイドロゲル構造が形成されたため、ハイドロゲルの機械的安定性が向上した。
SEM and TEM study of hydrogel formulations
gallic acid loaded PF127 のSEM画像（図. 8A,B）およびPF127/TMC/PEG-HA（図8C,D）の凍結乾燥状態のハイドロゲルは、凍結乾燥後に孔径が不規則な凝集した多孔質構造を示した。これは、水の除去によりハイドロゲルのすべての相互接続ネットワークが積層されたためであった。 それにもかかわらず、図8DのPF127/TMC/PEG-HA（図8Cの拡大青枠）の画像は、PF127単独（図8Aの拡大赤枠）の画像よりも、より特徴的な孔を持つより優れた相互結合ネットワークを示している。これは、TMCとPEG-HA55による修飾後にPF127チェーンのミセル間相互作用が強化されたからである。 また、元の製剤では多孔質構造がより相互結合していたため、修飾PF127系では薬物の徐放性および制御性がより優れていた
PF127のTEM画像 (Fig. 8E）およびPF127/TMC/PEG-HA（図8F）製剤のゾル状態では、100から1000 nmのサイズのミセル凝集体/相互接続ミセルを示し、図8Eの赤い点線の円および図8Fの青い点線の円で示すように、画像上でさまざまな形状の顆粒として表示されています。 図8に示すように、PF127/TMC/PEG-HAで形成されたミセル（F）は、PF127のみからなるミセル（E）よりもコンパクトで安定であることがわかった。 ミセルは主にPF127の高分子鎖によって形成されており，PF127/TMC/PEG-HA製剤中のTMCおよびPEG-HAが疎水性相互作用を通じて，PF127の安定でコンパクトなミセル間構造またはミセル凝集体の形成に影響を及ぼしていることが明らかとなった。 そのため、PF127/TMC/PEG-HAハイドロゲルからなる送達システムは、その安定したミセル間構造により良好な薬物放出を示すことができた。
SAXS study of hydrogels
ガラス板上にコーティングしたハイドロゲルの凍結乾燥体を反射SAXS装置上のサンプルホルダーと平行に設置し、SAXS測定を行った。 図9に示すように、ハイドロゲル試料のI（a.u.）の値をq（Å-1）に対してプロットしたものである。 反射モードでのSAXSは、X線が平らなサンプルにほぼ平行に当たるときに行われ、ハイドロゲルネットワークの不均質性の考えを与える56。 図9のI (a. u.) vs q (Å-1) のプロットは、q = 0.02 Å-1でピークを示し、これはハイドロゲルに見られる凍結不均一性の存在を示すもので、これはハイドロゲルの固有のネットワーク欠陥に起因する高電子密度の結晶化領域の存在に起因している57。
反射SAXSによるI (a.) の測定。 u.) vs q (Å-1) of drug loaded (A) PF127 and (B) PF127/TMC/PEG-HA hydrogels.
Zeta potential of hydrogel formulations
The zeta potential in the sol phase is measured 14 days to monitor the stability of components in the system during storage.Zeta potential of the formulationsは、保存期間中にシステムの成分の安定性をモニタリングした。 製剤中の成分の表面電荷は、その安定性、溶解性、クリアランス58を決定し、成分の表面電荷はゼータ電位によって測定される。 薬物（没食子酸）をゾル相に含むPF127およびPF127/TMC/PEG-HA製剤は、いずれも負のゼータ電位値を示した（表1）。 没食子酸を担持したゾル相のPF127は30℃で-18.7 mV ± 6.1という負のゼータ電位を示し，薬物（没食子酸）をゾル相に担持したPF127/TMC/PEG-HAは-16.3 mV ± 5.という正のゼータ電位値を示した． 表1に示すように，30℃で14日間保存した後のPF127およびPF127/TMC/PEG-HAのゼータ電位値は，それぞれ-18.7 mV ± 6.5，-14.6 mV ± 7.7であった。 したがって，保存期間中に両製剤のゼータ電位値に大きな変化が見られなかったことから，製剤中の全成分が沈殿することなく系内に均一に分布していることが確認された。 さらに、TMCとPEG-HAが反対に帯電しているため、PF127/TMC/PEG-HA製剤ではミセルの表面電荷が大きく変化せず、結果としてPF127/TMC/PEG-HAのゼータ電位はPF127のみを含む製剤のゼータ電位と同様であることがわかりました。
FTIR study of drug loaded hydrogels
Figure 10は、凍結乾燥形態で没食子酸を負荷したPF127/TMC/PEG-HAハイドロゲルの特徴的なFTIRピーク（cm-1）を示し、これらのピークは3445（O-Hストレッチ）、PF127、TMC、PEG-HAおよび没食子酸）である。 2891 (C-H 伸縮), PF127, TMC, PEG-HA, および没食子酸; 1644 (C=O 伸縮), TMC および PEG-HA; 1282 (C-O-C 伸縮), PF127, TMC, および PEG-HA; 1110 (C-C-O 対称伸縮) PF127; 964 (C-C-O 不対称伸縮, PF127)； がある。 没食子酸を担持したPF127ハイドロゲルのFTIR分析からも、同様の特徴的なピークが観察された。 凍結乾燥状態の没食子酸を担持したPF127ハイドロゲルのFTIRピークは、3445cm-1（O-H伸縮）、PF127および没食子酸；2891cm-1（C-H伸縮）、PF127および没食子酸；1282cm-1（C-O-C伸縮）、PF127；1110（C-C-O対称伸縮） PF127； および 964 (C-C-O 不対称伸縮） PF127 です。 両方のハイドロゲル製剤の3445 cm-1に見られる幅広いピークは、没食子酸がハイドロゲルに効果的に担持されていることを示唆しています。
薬剤担持デュアル応答（pH/温度）PF127 および PF127/TMC/PEG-HA Hydrogels の FTIR スペクトル。
累積放出試験
放出試験は、0.1M PBS (pH 7.4) および37℃でのPF127/TMC/PEG-HAおよびPF127ヒドロゲルからの没食子酸放出を調べるために実施しました (図11). 両製剤とも初期段階（5時間以内）で、PF127/TMC/PEG-HAとPF127ハイドロゲルはそれぞれ64.60% ± 1.112 と 50.31% ± 0.411 の薬剤放出量を示し、薬剤（没食子酸）のバーストリリースが見られた。 5日後、累積薬物放出量は87.61%±1.112および75.20%±0.411であった。PF127/TMC/PEG-HAとPF127ハイドロゲルでそれぞれ850を記録し、PF127にTMCとPEG-HAを加えた改良ハイドロゲルシステムが薬物送達システムとしてよりよく機能することが示された。 また、PF127/TMC/PEG-HAの形態変化、例えば、ミセル間相互作用の強化や良好な多孔性ネットワーク構造の形成は、中性pH条件下での薬物放出を改善することが示された。
(A) PF127 および (B) PF127/TMC/PEG-HA ヒドロゲルから 0.1 (M) PBS バッファで pH 7.4 および 37°C で 5 日間の累積薬剤放出 (%) を測定。 データは三重の放出実験の平均±SDを表し、薬物放出データを3つの異なる速度モデル0次、1次およびHiguchiに適合させた。
Figure 11 ヒドロゲルからの薬剤（没食子酸）の累積放出値は異なる速度モデルで適合され（図11）、全ヒドロゲル品種の異なる速度モデルの速度定数は表2に表わされる。
0次速度モデルは、式で与えられる。
ここでQtは時間t（h）におけるヒドロゲルからの薬剤放出の累積量、Qoはヒドロゲルにロードされた薬剤の初期量、k0は0次の速度定数（sec-1）である。 0次速度式による薬物放出速度は、ハイドロゲルにロードされた初期の薬物量に依存しない。
一次速度モデルは、以下の非線形形式で与えられる。
ここでQtは時間t（h）におけるヒドロゲルからの薬剤放出の累積量、Qoはヒドロゲルにロードした薬剤の初期量、k1は1階速度定数（秒-1）である。
Higuchi速度式は拡散法によるハイドロゲルからの薬物放出を示唆し、Higuchi速度式の非線形形式は次の通りである：
ここで、Qtは時間t（h）におけるハイドロゲルからの累積薬物放出量、kHはHiguchi定数（sec-0.図11）。没食子酸を担持したPF127およびPF127/TMC/PEG-HAハイドロゲルは、本研究で使用した他の速度モデルから得られた値よりも高い0.990のR2値を示し、ハイドロゲルの薬剤放出速度が一次速度方程式に密接に従うことが示された。 したがって、ハイドロゲルからの薬物放出速度は、ハイドロゲルに担持された薬物の初期濃度に依存することがわかった。 表2に見られるように、k1（sec-1）は、両方の品種のハイドロゲルについて他の速度定数よりも低く、したがって、ハイドロゲルからの薬物の徐放は、ここで使用した他のどの速度モデルよりも、より密接に一次速度モデルに従っている
。