今回、我々は急性静脈内容量負荷による0.9%食塩水、3%食塩水、等張グルコースの急性静脈内投与がu-AQP2およびu-ENaCγに及ぼす影響を健常者の無作為クロスオーバー試験で検討した。 その目的は、ネフロン遠位部の主要細胞におけるアクアポリン2水チャネルおよび上皮ナトリウムチャネルを介した輸送活性を評価することにある。
輸液中およびその直後には、腎機能および血管作動ホルモンに適応的な生理的変化が起こる。 従って、効果変数の主な変化は点滴後に起こると予想された。 そこで本研究では、輸液終了後60〜90分の最後の輸液期間（Post infusion 210〜240）における効果変数の変化に注目した。 この間，u-AQP2は高張食塩水および等張食塩水の注入後に増加し，ブドウ糖の注入後に減少した． また，u-ENaCγは高張食塩水投与後に増加し，等張食塩水およびグルコース投与後には変化しなかった。
U-AQP2 hyponic, isotonic saline and isotonic glucose注入後
Aquaporin-2 (AQP2) は集合管主細胞内にあり，頂膜細胞で発現する． バソプレシン（AVP）は側底膜のV2受容体に結合してAQP2を制御している。 AVPに短期間さらされると、AQP2を含む細胞内小胞の先端膜への輸送と挿入が起こり、水の透過性と吸収性が増加する . 長期的な調節は数時間から数日の間に起こり、AVPによる遺伝子転写がAQP2の全細胞量を増加させることによって引き起こされる . ラットの実験では、dDAVPを注入するとu-AQP2が増加することが示された。 このことは、AVP刺激によりAQP2チャネルのアピカル膜への送達が増加し、AQP2の排泄が増加するという見解と一致する .
3%高張食塩水による体積膨張は視床下部のオスモレセプターの閾値を超えて血漿浸透圧を上昇させ、AVPの放出とそれに続くu-AQP2の上昇を誘発する． 斉藤らは、健常者において5％高張食塩水投与後の尿中AQP2排泄量とp-AVPの間に有意な関係を見出した。 Pedersen らは、24 時間の水不足時および 3%高張食塩水注入後に、u-AQP2 と p-AVP の間に正の相関を見いだした。 このように、これまでのヒトでの研究から、AQP2水チャネルの活性はu-AQP2を測定することによって決定できることが明らかになっている。 驚くべきことに、Baumgartnerらは、健康なボランティアに2.5%NaClを注入しても、尿浸透圧とAVPの両方が著しく上昇したにもかかわらず、u-AQP2に変化がないことを見いだした 。 しかし、点滴前の経口水分負荷は我々の研究に比べて3-4倍高かった。 このため、高張食塩水による尿酸分泌促進作用が、点滴前の大きな水分負荷によって打ち消された可能性がある。 その結果，予想通り，3％NaCl投与後にu-AQP2が上昇し，それに伴って尿浸透圧が上昇し，CH2Oが減少した． このことから、遠位尿細管においてアクアポリン2水チャネルを介した水の再吸収が促進されたことが示唆された。 u-AQP2の上昇に先立ち、高張食塩液の注入によりp-osmとp-AVPの急激な上昇がみられた。 動物実験では，高張力が頂膜のAQP2発現をAVP単独発現と同程度に上昇させることが示されている． このことは、u-AQP2の排泄の増加に積極的に関与している可能性を排除することができない。 おそらく水再吸収の増加はp-AVPの増加によって媒介されたのであろう。 また，U-AQP2は検査日中も上昇を続け，p-AVPの上昇によりAQP2チャネルが先端膜に挿入され活性化されたことが示唆された． 本研究では、0.9%NaClの注入により、3%NaCl注入と同様にu-AQP2、u-osm、CH2Oに、より低い程度ではあるが、同様の反応がみられた。 p-osmは0.5%の上昇に相当する286 mosmol/kgの最大値までわずかに上昇した。 この上昇はオスモレセプターの閾値以下であり、p-AVPの有意な変化は見られず、また期待もされなかった。 したがって、AVPは0.9%NaCl中におけるAQP2の主要な調節因子とはなりえなかった。 おそらく、AQP2を介した水輸送の増加は、等張性容量拡張後に起こる近位尿細管での腎臓の水分吸収の減少に対抗するための代償現象であると思われる。 そのメカニズムは、ナトリウム利尿ペプチド系の活性の上昇によるものかもしれない。
5%グルコースの注入は、体液相全体に分散した体積膨張を引き起こし、血漿量の増加はごくわずかであった。 これは血漿アルブミンの測定に示されており、240分後の濃度はベースラインとほぼ同じであり（表4）、細胞外液に変化がないことを示している。 我々の知る限り、ブドウ糖輸液後のu-AQP2を測定した研究はない。 健常者を対象とした研究では、20mL/kgの水を15分間経口投与（平均摂取量1605ml）すると、210分後にu-AQP2が17%減少することが示された。 最近の研究では、20ml/kgの水を15分間経口投与（平均摂取量1389ml）したところ、240分後にu-AQP2が27%減少した。 血漿浸透圧とp-AVPはともに低下した。 このように，経口水摂取後の水利尿時にu-AQP2が減少することが示された． その結果、u-AQP2crが16%減少し、u-osmが減少し、UOとCH2Oが増加した。 血漿浸透圧は285mosm/kgから280m0sm/kgに2％低下したが、p-AVPは低下しなかった。 この結果は、等張グルコース注入後、遠位尿細管におけるアクアポリン2水チャネルを介した水の再吸収が減少していることを示唆している。 p-AVPが変化しなかったのは、まず、輸液開始前に1225mlの経口水分負荷を受けていたため、ベースライン時のAVPが事前に抑制されていた可能性が考えられる。 第二に、p-AVP濃度の測定は、わずかな減少を検出するのに十分な感度を有していない可能性がある。 また、最近発見されたペプチドApelinが関与している可能性もある。 アペリンは視床下部の大細胞性神経細胞でAVPと共役している。 健康な男性ボランティアで、水負荷により血漿のオスモル濃度を下げると、p-AVPはわずかに減少するが、p-Apelinは急速に増加する。 アペリンの調節はAVPの調節と逆であり、AVPと同様に水のホメオスタシスの調節に関与している可能性を示唆するデータであった。 p-Apelinは測定していないが、異なる体積膨張の条件下でp-AVPと並行して血漿Apelinを調べることは興味深かったかもしれない。
したがって、注入後の最後の期間に、高張および等張食塩水注入後にu-AQP2はほぼ同じ程度増加したが、等張ブドウ糖注入後には著しい低下が観察された。 u-AQP2の変化の遅れについては、AVPの変化が頂膜からのAQP2の挿入あるいは除去によって主細胞に作用するのに数分かかるが、尿中のu-AQP2の排泄にその影響が現れるまでに数分かかるという説明が可能であろう。
U-ENaCγ with infusion with hypotonic and isotonic saline and isotonic glucose
集合管でのナトリウム輸送は上皮ナトリウムチャネルを介して起こり、濾過ナトリウムの3-5%の再吸収を担っている. ENaCはα、β、γの3つのサブユニットからなり、主細胞の先端細胞膜に局在する。 ENaC は、ミネラルコルチコイド受容体に作用するアルドステロンの標的である。 アルドステロンは、ENaCサブユニットを細胞内からアピカル膜に再分配するとともに、遺伝子転写を変化させることにより、ナトリウム輸送を増加させる . アルドステロンの作用は数時間から数日にわたって起こりますが、もう一つの相乗的な経路としてAVPが関与しています . ラットの皮質集合管において、AVPはV2受容体に結合し、cAMPを刺激し、ENaCのトラフィッキングとアピカル膜への挿入を促進し、チャネル活性を急速に変化させることによってナトリウム再吸収を増加させる ……。 ヒトにおける最近の研究では、AVP が V2 受容体を介して、主細胞を介した ENaC によるナトリウム再吸収を刺激することが実証された
ENaC の断片は、通常尿中に排泄される。 ENaC分画の量は、u-AQP2がAQP2水チャネルの機能状態を反映するように、上皮のナトリウムチャネルを介したナトリウム輸送の活性を反映すると考えられている。 最近、我々のグループは遠位尿細管の主要な細胞におけるナトリウム再吸収を評価する新しい方法を導入しました。 Lauridsenらは、健常人の尿中ナトリウム排泄量の変化とβ画分（u-ENaCβ）の尿中排泄量の変化との間に有意な相関があることを証明しました 。 このことから、u-ENaCβはENaCを介したナトリウムの輸送のバイオマーカーとして利用できることが示唆された。 本研究では、上皮性ナトリウムチャネルのタンパク質のγ画分を測定し、γ-ENaCの発現の上下調節とENaCを介したナトリウム輸送を評価した。
遠位化尿細管（DCT）のナトリウム・クロライド・シンポルター（NCC）は、ナトリウム再吸収経路としてもう一つの重要な役割を担っている。 遠位尿細管におけるナトリウム再吸収は、集合管の主要な細胞へのナトリウム供給量を決定するために不可欠である。 NCCはAng IIとアルドステロンによって制御されていることが広く知られている。 また、高濃度のAVPはNCCのリン酸化を増加させ、おそらくナトリウムの再吸収をより大きくすることが研究で示されている
動物実験では、等張および高張食塩水の静脈注射は近位尿細管でのナトリウム再吸収を減少させて、尿中のナトリウム量を増加させることが示されている . Andersen LJらは、食事をコントロールした健康な被験者を対象に、高張および等張生理食塩水の効果を検討しました。 25ml/kgの等張食塩水または4.5ml/kgの3％高張食塩水を90分間静注し、ナトリウムを負荷した。 尿中ナトリウム排泄量は等張食塩水、高張食塩水ともに増加し、高張食塩水後のナトリウム排泄量は等張食塩水後のそれを上回った。 血漿ナトリウムと血漿浸透圧は，p-AVPと同様に高張力食塩水投与後に大きく上昇した． 3%NaCl注入により、u-ENaCγ、FENa、p-Osm、p-Na、p-AVPが上昇した。 したがって、我々の発見は、主細胞におけるENaCを介したナトリウム再吸収の増加を反映しており、さらにAndersenらによる結果を確認するものであった。 u-ENaCγの増加は、ネフロン近位部での腎臓のナトリウム吸収がかなり低下し、遠位部での吸収の増加によって補われ調整されていることで部分的に説明できるかもしれない。 しかし、3％NaCl注入直後に見られたp-AVPの上昇は、u-ENaCγの増加がAVPの作用によるものであることも示唆する。 ENaCを介して内腔から細胞へのナトリウムの移動が増加すると、理論的にはROMKチャネルを介してカリウムの分泌が促進されることになる。 意外なことに、我々は尿中のカリウムの排泄量の減少を測定した。 このことは、ENaCを介したナトリウム輸送が主要な役割を担っていることを否定するものであろう。 もし、NCCが近位再吸収の減少を補うためと高p-AVPのためにナトリウム再吸収を増加させたなら、ENaCによって輸送されるナトリウムは少なくなり、カリウムの分泌は起こらなくなるであろう。 高張食塩水注入後のNCCの役割の可能性は、NCCの活性を測定しなかったので、純粋に推測に過ぎない。 おそらく、我々の制限時間内では、カリウム分泌に対する正の効果が見られなかったのであろう。 しかし、カリウムの輸送は複雑であり、尿細管の流れの変化やアルドステロンなど、カリウムの輸送を調節する要因は多い。
等張食塩水による容量拡張後、オンコティック圧はわずかに減少し、その結果GFRが直ちに上昇し、近位尿細管における水の再吸収が小さくなる。 GFRとUOの出力がわずかに増加したことを測定した。 ナトリウム排泄量は増加したが、u-ENaCγ、p-Na、p-osm、p-AVPは変化しなかったので、予想通りの所見であった。 NCCについては、等張食塩水中でのNCCを介したナトリウム再吸収の変化は期待できない。
これまで水利尿中のu-ENaCγを評価した試験はない。 我々の研究では、主細胞のENaCを介したナトリウム再吸収のわずかな減少を反映して、グルコース注入後にu-ENaCγの減少傾向を測定した。 グルコース注入後、p-osmolalityは2％低下し、理論的にはAVPの減少を誘発するはずである。 p-AVPの低下は検出されなかったが、これは事前に経口水分負荷によりp-AVPが低下したため、あるいはp-AVP濃度の測定が微小な変化を検出するのに十分な感度を有していない可能性があるためと推定される。 u-ENaCγの減少は、主細胞の基底膜にあるV2受容体にAVPが結合しないためではないかと推測される。 AVP刺激不足はENaCチャネルの膜表面からリサイクル小胞へのエンドサイトーシスを増加させ、ナトリウムの再吸収を減少させた。 p-osmとp-AVPの上昇は3%NaCl輸液停止直後から見られた。 高張食塩水投与後にu-ENaCγが遅れて一定の値を示したのは、AVPで刺激した後、ENaCチャネルの細胞内デポの頂膜への輸送が増加するのに数分かかるが、尿中への排泄には数分かかるからであろうと思われる。
血管作動性ホルモン
AVPに加えて、レニン-アンジオテンシン-アルドステロン系（RAAS）は、腎のナトリウム排泄とそれによる体液量の主要な調節因子である。 ナトリウム枯渇がRAASを活性化し、慢性的なナトリウム負荷がRAASを低下させることはよく知られている。 In vitro および in vivo の研究では、アルドステロンがミネラルコルチコイド受容体を刺激して、ENaC や Na,K-ATPase などのナトリウム輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子の転写が増加することが示されている
血液量の変化に関する多くの研究により、急性変化はレニン-アンジオテンシン-アルドステロン系の逆調整と関連していることが示されました。 本研究では、3％および0.9％の生理食塩水による体積膨張は、PRC、p-AngIIおよびAldoの同等かつ有意な減少をもたらし、細胞外容積の増加と一致していた。 グルコース注入後，PRC，p-AngII，p-Aldoに有意な変化は認められなかった． これは，グルコース注入が細胞外容積に顕著な変化を与えないことから予想されたことである． アルドステロンの作用は数時間から数日にわたって起こるため、我々の研究はアルドステロンの調節作用を認めるようにデザインされていない。 9363>
Strengths and limits
この研究の主な強みは、健康な若い男女の均質なグループによる無作為クロスオーバー研究として設計されていることである。 試験条件は、食事、ナトリウム、水分の摂取に関して非常によく定義されていた。 従って、塩分や水分のバランスの違いによって結果が混乱することはない。 この研究は、体積膨張の急性効果のみを調査したものである。 もし、輸液後の期間がもっと長ければ、体積膨張の長期的効果、AQP2およびENaCγの尿中排泄に関して、より多くの情報を得ることができたであろうことは疑いない。 さらに、この試験はプラセボ対照ではなく、ごく少量の0.9％生理食塩水を点滴する方法であった。 これにより、体積膨張の効果を、水分および塩分の再吸収の全体的な変動と区別することができたかもしれない。 この研究では、ANPの測定は不可能であった。 ANPの測定は、我々の結果に好影響を与えたかもしれない。