Escher-FBA の実際のアプリケーションへの使用を示すために、ブラウザで直接実行できる4つの主要なFBA例を紹介します。 これらは、FBAとそのアプリケーションのレビューから採用されたものである。 これらの例は、大腸菌のデフォルトのコアモデルに依存しているので、Escher-FBA のウェブページを開いたらすぐに実行できます。 各例の間にある「Reset Map」ボタンを必ずクリックしてください。
FBA with alternate carbon substrates
最初の例は、FBA を使って代替炭素基質上で成長が起こるかどうかを予測することを示しています。 大腸菌のデフォルトのコア モデルには、炭素源として D-グルコースを使用した最小限の培地がシミュレートされています。 ここでは、炭素源をD-グルコースからコハク酸に切り替えてみます。 まず、コハク酸交換反応EX_succ_eにマウスオーバーし、スライダーをドラッグするか、Lower Boundフィールドに-10を入力して、下限を-10 mmol/gDW/hrに変更します。 次に、D-グルコース交換反応EX_glc_eにマウスオーバーし、下限値を0に上げるか、ノックアウトボタンをクリックします。 デフォルトの目的は依然として成長を最大化することなので、これら二つの変更により、D-グルコースの代わりにコハク酸を炭素源として使用しながら最大成長率を計算するよう、プログラムに指示します。 予測される最大増殖速度が 0.874 h- 1 から 0.398 h- 1 に減少し、大腸菌のコハク酸での増殖収量が低いことがわかるはずです (Fig. 2a)． これは、Escher-FBA で変更を加える一般的な方法です。反応にマウスを合わせ、必要な変更を加えれば、Escher-FBA は自動的に結果を表示します。 炭素源交換の下限値は実験値を表しているので、他の炭素源で成長する場合は、特定の下限値を現実的な値に調整してみてください。
Escher-FBA シミュレーション例。 (a)コハク酸を唯一の炭素源とした成長のシミュレーション。 (b)グルコース最小培地での嫌気性生育をシミュレート。 (c)デフォルトモデルでのATP収量の最大化。 (d) S. cerevisiaeのiMM904モデルでの成長。 設定メニューで矢印の幅を大きくして変化をわかりやすくしたことに注意
FBA during anaerobic growth
EX_o2_e reactionにマウスオーバーしてKnockoutをクリックするか下限を0に変更すれば同じように無酸素成長をシミュレーションすることが可能です。 コハク酸がまだ唯一の炭素源であるときに酸素交換をゼロに変更すると、Flux Through Objectiveインジケータは「Infeasible solution/Dead cell」と表示し、成長が不可能であることを意味します。 右下のResetボタンをクリックして、D-グルコースを炭素源とする最小限の培地をシミュレーションし、EX_o2_eをノックアウトすると、予測される成長速度は0.211 h- 1となるはずです（図2b）。
FBA with compound objectives
Escher-FBA では Compound Objectives モードで複数の目的の設定をサポートしています。 デフォルトのモデルでは、新しい目的を設定すると、常に前の目的が無効になります。 このモードを有効にするには、まず、画面下部のCompound Objectivesボタンをクリックします。 このモードの使用例として、SUCDi を通過するフラックスを最小化しながら、最大成長率を確認するために、バイオマス生産量を最大化するデフォルトの目的から開始します。 次に、SUCDi の反応ラベルにマウスオーバーして、ツールチップ内の Minimize ボタンをクリックします。 右下に両方の目的が表示されるはずです． 現在，目的係数は 1 または -1（Maximize と Minimize で表される）のみサポートされていることに注意してください．
Analysis of metabolic yields
ATP のような前駆体や補因子の最大収率を決定するためにも Escher-FBA を使用することができます。 必要なのは、関心のある補酵素を消費する化学量論的にバランスの取れた反応です。 ATP維持（ATPM）反応は、そのような例の1つです。 ATP の最大生産量を決定するためには，単に ATPM 反応にマウスオーバーして，Maximize ボタンをクリックする． このように目的を設定することは，システムが ATPM 反応を通してフラックスを最大化するために，まず ATP を可能な限り大量に生産しなければならないので，うまくいきます． 大腸菌のデフォルトのコア代謝モデルでATPMを最大化すると、目的値は175 mmol/gDW/hrになります。 (図2c)。 コハク酸を炭素源とした場合、この値は82.5 mmol/gDW/hrに減少する。 これと同じ手順で、化学量論的にバランスの取れた消費反応を作成し、その反応によるフラックスを最大化するようにモデルを設定すれば、目的の代謝物に対して行うことができます。
Flux variability analysis
Analyzing alternate optimal solutions in metabolism is another useful application of FBA.現在、Escher-FBAでこのような反応を自動的に作成することはできませんが、これは将来のリリースに追加することができます。 FBA によって生成される解はしばしば一意ではないので、特定の反応が持ちうるフラックス値の範囲を知ることは有用です。 Flux Variability Analysis (FVA) は、ネットワーク全体のこれらの範囲を計算するためによく使われます。 Escher-FBA は FVA の計算を直接サポートしていませんが、与えられた反応について計算することは可能です。 そのためには、まず目的関数（バイオマス反応 Biomass_Ecoli_core_w_GAM）をマウスオーバーして、上限と下限を現在のフラックス値より少し小さく設定します（デフォルトマップでは 0.870 を試してみてください）。 次に，興味のある反応の上にマウスを置き，Maximize と Minimize ボタンをクリックすると，最適な成長率でその反応を通るフラックスの最大値と最小値が表示されます． 例えば、解糖系の GAPD を通るフラックスを最大化および最小化すると、実行可能なフラックス範囲は 15.44-16.68 mmol/gDW/hr となり、解糖系フラックスは高い成長率で非常に制約されることがわかります。 一方、グリオキシル酸シャントのMALSを介したフラックスを最大化および最小化すると、実現可能なフラックス範囲は0〜2.64 mmol/gDW/hrとなり、グリオキシル酸シャントが高い成長速度で活性または非活性になることが示される。 この手順は任意の反応セットで行うことができ、ユーザーは任意の数のフラックス値にシステムを制限して、特定の反応に利用可能なソリューションの範囲を見ることができます。 例えば、酵母の細胞でシミュレーションを行いたい場合、Saccharomyces cerevisiaeのモデルとマップはhttp://bigg.ucsd.edu/models/iMM904からダウンロードできます。 そのページで、モデル（iMM904.json）とマップ（iMM904.Central carbon metabolism.json）のダウンロードボタンをクリックする。 これらをEscher-FBAで読み込むには、MapメニューのLoad Map JSONとModelメニューのLoad Model JSONをクリックして、両方のJSONファイルを読み込んでください。 一度ロードしたマップは、EscherやEscher-FBAのどのツールでも編集やシミュレーションができるようになります（図2d）。 iMM904のような大きなモデルでは、すべての反応が一度に見えるわけではありませんが、反応を可視化に追加することができます。 まずサイドバーのレンチアイコンをクリックするか、Edit メニューから Add reaction mode を選択します。 これで、地図上の任意の場所をクリックし、ドロップダウンメニューから目的の反応を選択することで反応を追加することができます。
Application of Escher-FBA to microbial cell factory design
Escher-FBA を使って検証できる研究仮説の例として、化学生産のために 1-propanol を生産する 2 つのルートを含む大腸菌のゲノムスケールモデルをロードしました。 これらの経路は、最近、実際の微生物細胞工場株をシミュレートするためのゲノムスケールモデルの予測力に関する研究で分析されたものです。 最初のモデルは、渥美らによって最初に報告された1-プロパノール生産経路（Additional file 1）である。 2 番目のモデルは、Shen and Liao によって初めて報告された 1-propanol 生産の 2 つの相乗的経路（Additional file 2）を含んでいます . それぞれのモデルは別々に（Model > Load COBRA model JSON menu buttonで）ロードでき、両方のモデルに対応した中心代謝の地図が提供されています（Additional file 3, can be loaded with Map > Load Map JSON）。 そこで、各モデルを個別に読み込み、1-プロパノールの排泄量を最大化し（EX_1poh_eにカーソルを合わせて最大化をクリック）、排泄量の下限を最大値の99％に設定し、ペントースリン酸経路の最初のステップであるグルコース6-リン酸脱水素酵素（G6PDH2r）を通るフラックスを最小化させました。 その結果、1-プロパノール生産のための相乗的経路は、解糖と化学量論的にバランスがとれており、PPP活性を必要としないことがマップから示された（Fig.3b）。 一方、個々の経路では、かなりのPPPフラックスが必要であることがわかった（Fig.3a）。 それぞれの場合に必要なTCAフラックスなど、他の経路の使用法もこれらのマップ上で探索できる。
E. coliにおける1-プロパノール生産の異種経路の2経路使用法。 それぞれの異種生産経路に必要なペントースリン酸経路（PPP）フラックスは、第一に、1-プロパノールの生産量を最大値の99％に強制し（1-プロパノール交換反応の下限を設定）、第二に、PPPの第一段階を通るフラックスを最小にすることで比較することが可能である。 (a）渥美らが報告した1-プロパノール経路は、1-プロパノール生産を達成するために1つの経路を使用しています。 PPPフラックスを大量に必要とし、全体の収率も低い。 (b) Shen and Liaoによって報告された経路は、2つの経路を相乗的に使用して高い収率を達成している。 この経路は解糖と化学量論的にバランスが取れているため、PPPフラックスは必要ありません
Escher-FBA はすでに多くの FBA シミュレーションにウェブブラウザで直接使用できますが、Orth らによって示された多くの例は現在 Escher-FBA で達成することはできません。 今のところ、Escher-FBAでは、遺伝子ノックアウト解析やロバスト性解析などの機能を実現することはできません。 しかし、Escher-FBAは視覚的要素に柔軟なSVG表現を用いているので、ロバスト性解析や、位相平面のようなグラフィカルな機能を追加することが可能です。 私たちは、Escher-FBAの開発ロードマップ（ホームページhttps://sbrg.github.io/escher-fbaから入手可能）を策定し、最終的にはWebブラウザで複雑なシステムバイオロジー解析を可能にするための反復的な開発プロセスを確立しています
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